銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)是常見的非發(fā)酵糖G-專性需氧小桿菌,廣泛存在于土壤、水、污物、植物和動物中,常定植于健康人的上呼吸道、腸道和皮膚等處,是免疫抑制個體重要的機(jī)會致病菌。銅綠假單胞菌感染一旦發(fā)生,多為慢性病程,引起肺實(shí)質(zhì)損傷,常導(dǎo)致患者死亡。由于銅綠假單胞菌膜對藥物滲透障礙,引起多種抗生素天然耐藥。在治療過程中,通過基因突變發(fā)生耐藥,使銅綠假單胞菌感染治療十分棘手,死亡率高。疫苗是預(yù)防感染性疾病發(fā)生的有效方法,本文介紹了6種Pa疫苗構(gòu)建及其免疫機(jī)制等方面的研究進(jìn)展。

1 滅活疫苗

滅活疫苗(inactived vaccine)又稱為死疫苗,是病原體大量培養(yǎng)以后,經(jīng)理化方法滅活后制成。Cripps等〔1〕應(yīng)用 Boehringer-Ingelheim 制備的低壓冷凍甲醛滅活的Pa385株(2血清型、21/44/109/110X/1214噬菌體型)腸溶口服疫苗Pseudostat,每粒150 mg,含 2×1011CFU。1 d、28 d給予健康志愿者150 mg口服免疫,末次免疫后觀察2 w,安全性良好。在免疫14 d后,血清特異性的IgA抗體明顯增加,持續(xù)到42 d;血清特異性的IgM 抗體也明顯增加,28 d恢復(fù)正常;在整個觀察期IgG無明顯變化,提示疫苗不能很好誘導(dǎo) Th1型免疫反應(yīng);免疫血清能明顯增加巨噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬作用。

2 減毒活疫苗

減毒活疫苗(live-attenuated vaccine)是用減毒或無毒力的活病原微生物制成。aroA基因編碼5-烯醇酮莽草酸三磷酸合成酶,是植物和細(xì)菌合成芳香族氨基酸的關(guān)鍵酶。Priebe等〔2-3〕用 108CFU、5×108CFU和109CFU PAO1△aroA減毒活疫苗依次遞增鼻腔免疫C3H/HeN和BALB/c小鼠,1次/w,共3次,未出現(xiàn)毒性反應(yīng),4 d后肺部是無菌的。末次免疫3w后用ExoU+PAOl和O2/O5血清型PAO1攻擊,全部小鼠存活,3 d后對照組全部死亡;用不同血清型Pa攻擊疫苗組,未能得到好的保護(hù)率;不同類近交小鼠產(chǎn)生的保護(hù)率不同;與對照組相比,在疫苗組ExoU+PAOl引起的氣道急性炎癥明顯減輕,能維持正常的肺泡結(jié)構(gòu);腹腔注射1 mg來源于鼻腔接種0.25 mg疫苗小鼠的IgG抗體,在低于主動免疫PAO1△aroA疫苗免疫劑量組有高水平的保護(hù)力。Zaidi等〔4〕用同樣減毒活疫苗依次遞增鼻腔免疫C3H/HeN小鼠,1次/w,共3w。末次免疫4w后,用 4 000倍 ID50(50%infectious dose,ID50)的不同血清型和不同毒力的銅綠假單胞菌攻擊,均沒有觀察到眼睛的病理損傷,直至7 w仍有顯著保護(hù)力。在被動免疫研究中,不同血清型和不同毒力的銅綠假單胞菌劃傷感染眼結(jié)膜,在感染前18 h和感染后2 h腹腔注射鼻腔免疫PaO1△aroA減毒活疫苗的血清,均獲得顯著保護(hù)性;用不同血清型銅綠假單胞菌1.4×107CFU角膜感染后3 d,腹腔注射鼻腔免疫PaO1△aroA減毒活疫苗的小鼠血清,仍能明顯減輕角膜的病理損傷;證實(shí) PaO1△aroA減毒活疫苗血清不僅有抗菌活性,而且能阻止銅綠假單胞菌進(jìn)入角膜上皮細(xì)胞。研究結(jié)果提示減毒活疫苗是安全有效的,同一疫苗對不同部位的Pa感染,保護(hù)力不同。

3 結(jié)合疫苗

結(jié)合疫苗(conjugate vaccine)是將多糖等T細(xì)胞非依賴性抗原與蛋白載體結(jié)合制成。黏液胞外多糖(mucoid exopolysaccharide,MEP),又稱為藻酸鹽,是由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸通過β1-4糖苷連接形成的多聚物。Pier等〔5〕發(fā)現(xiàn)MEP免疫小鼠后能夠產(chǎn)生調(diào)理性抗體,有利于呼吸道清除銅綠假單胞菌,但是,單純的MEP疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體不足10%。Theilacker〔6〕成功制備KLH-MEP 結(jié)合疫苗,最佳免疫劑量是1 μ g/只,免疫C3H/HeN 小鼠,誘導(dǎo)出高濃度MEP特異的IgM和 IgG抗體,IgG在第2次免疫7 d后開始增加,第3次免疫后顯著增加,35 d達(dá)高峰,持續(xù)到63 d。高劑量的MEP和KLH混合物免疫后僅產(chǎn)生MEP特異的IgM和KLH特異的IgG抗體,并不產(chǎn)生MEP特異的IgG抗體,提示KLH是良好的T細(xì)胞非依賴性抗原結(jié)合載體。陸淼泉等〔7〕將MEP與B群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)通過Hurwitz方法交聯(lián)成功制備MEP-OMPC結(jié)合疫苗。1 d、7 d和14 d免疫小鼠3次,每次50 μ g/只,21 d和28 d誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗MEP的調(diào)理性IgG抗體;29 d用1×107CFU黏液型銅綠假單胞菌腹腔攻擊的保護(hù)率85%,能有效預(yù)防銅綠假單胞菌的全身感染。

4 DNA疫苗

DNA疫苗(DNA vaccine)是將編碼病原體有效免疫原基因插入質(zhì)粒構(gòu)建重組體,經(jīng)過注射等途徑進(jìn)入機(jī)體,轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,表達(dá)保護(hù)性蛋白抗原,誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫。陳建國等〔8-9〕將銅綠假單胞菌OprF 3個中和性B細(xì)胞表位和1個外源通用T細(xì)胞表位串聯(lián),采用重疊PCR方法合成DNA,在此序列前插入組織纖溶酶原激活物(tPA)的信號肽基因,將獲得的片段與 MyD88基因分別克隆到pIRES載體的兩個多克隆位點(diǎn),構(gòu)建真核雙表達(dá)重組質(zhì)粒 pIRES-tPA-OprF-MyD88。將該疫苗 50 μ g/次,間隔2 w,免疫3次,末次免疫2 w后采血檢測抗體,疫苗組產(chǎn)生高水平的OprF特異性抗體,機(jī)體清除銅綠假單胞菌的能力明顯增強(qiáng)。Price等〔10〕將長度為977 bp的oprF基因亞克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pVR1020纖溶酶原信號序列的下游,在大腸桿菌中擴(kuò)增,成功構(gòu)建 pVR1020/oprF基因疫苗。于0 d 、14 d 和 28 d,pVR1020/oprF 基因疫苗(2 μ g/只)免疫ICR小鼠,末次免疫2 w后收集血清檢測,主要是IgG1。IgG1/IgG2a為10.33,提示是 Th2型免疫反應(yīng),有利于抗體產(chǎn)生;用瓊脂包埋7×102CFU銅綠假單胞菌FD4,接種在左支氣管,評價疫苗對慢性感染的保護(hù)力,空載體對照組存在嚴(yán)重肺損傷小鼠比率是76.2%,細(xì)菌定量(＞5×103)的比率是69%,而疫苗組分別是43.2%和40.9%,提示保護(hù)力不高。

5 重組抗原疫苗

重組抗原疫苗(recombinant antigen vaccine)是利用DNA重組技術(shù)制備只含保護(hù)性抗原的純化疫苗。Mansouri等〔11〕將 oprF-oprI基因亞克隆入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建pT rcHis-F-I重組質(zhì)粒,成功表達(dá)和純化獲得分子量為33 kD Met-Ala-(His)6-OprF190-342-OprI21-83融合蛋白 疫苗。 用 20 μ g、50 μ g、100 μ g 或 500 μ g 分別免疫健康志愿者 ,1 次/4 w,共3次,觀察6個月。所有疫苗組IgG1抗體均顯著增加,500 μ g組在第1次免疫后就有增加,其余組在第2次免疫后增加,提示抗體產(chǎn)生與接種疫苗劑量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)疫苗組血清能增加73%接種者的調(diào)理吞噬活性。D?ring等〔12〕進(jìn)行了Pa二價鞭毛疫苗3期臨床試驗(yàn),該疫苗由20 μ g亞型為a0a1a2和20 μ g亞型為b鞭毛蛋白組成。肌肉注射疫苗3次,每月1次,1年后加強(qiáng)注射1次,產(chǎn)生高滴度的IgG、IgA和SIgA抗體;能減少66%的囊性纖維化病人感染銅綠假單胞菌。Weimer等〔13〕將flic、oprF和oprI基因亞克隆入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET29a,成功表達(dá)OprF311-341-OprI-flagellins融合蛋白,經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),OprF311-341-OprI-flagellins融合蛋白既有利于PA的清除,又能減輕繼發(fā)性肺部損傷,是較理想的候選疫苗。Peluso〔14〕等用來源于PAO1菌株天然 OprF(native OprF,n-OprF)和pET28a-OprF在大腸桿菌BL21表達(dá)重組OprF(histidin-conjugated OprF,His-OprF)體外刺激小鼠DCs(dendritic cells),評價抗PA保護(hù)力和炎癥反應(yīng)。n-OprF和His-OprF刺激DCs誘導(dǎo)相似的共刺激分子(CD80和CD86)和細(xì)胞因子的表達(dá),產(chǎn)生高水平的IL-12p70,和低水平的IL-10以及IL-6,提示以Th1型免疫反應(yīng)為主?；剌敱淮碳Cs給C57BL/6,1w后,經(jīng)鼻腔感染 3×107CFU PAOl和囊性纖維化病人分離的黏液型PA,在PAOl感染4 d和7 d后,n-OprF組根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明有顯著保護(hù)力,His-OprF組在第4 d顯著減少,對照組無細(xì)菌的清除;與對照組比較,局部肺組織勻漿TNF-α顯著減少,IL-12p70和IL-10增加,局部淋巴結(jié)IFN-γ增加,IL-4和IL-10減少,支持局部炎癥反應(yīng)減輕的組織病理學(xué)的表現(xiàn)。在黏液型Pa感染7 d后,細(xì)菌清除延遲,有大量細(xì)菌存在,但明顯抑制細(xì)菌的生長;盡管與對照組比較,IL-12p70/IFN-γ增加,IL-4減少,但 TNF-α無顯著降低,炎癥反應(yīng)減輕程度也不及非黏液型PaO1感染后。由此可見,疫苗的保護(hù)力與病原體的清除,炎癥病理的輕重,引流淋巴結(jié)是否以Th1型免疫反應(yīng)為主有關(guān),抗體可以保護(hù)機(jī)體免受PA感染,Th1型免疫反應(yīng)有利于Pa的清除。

6 重組載體疫苗

重組載體疫苗(recombinant vector vaccine)是將編碼病原體有效免疫原的基因轉(zhuǎn)入載體(常見的是減毒病毒和細(xì)菌),并能在載體中表達(dá),隨疫苗株在體內(nèi)繁殖使大量抗原得以表達(dá)而制成的疫苗。DiGiandomenico等〔15〕將編碼 PA O11 血清型基因克隆入pLAFR1質(zhì)粒,改稱pLPS2,經(jīng)過三親雜交轉(zhuǎn)入aroA突變鼠型腸沙門氏菌減毒株SL3261,成功構(gòu)建LPS沙門氏菌重組載體疫苗。用該疫苗免疫BALB/c小鼠,分為口服和腹腔注射組?？诜M能誘導(dǎo)高水平的IgG和IgA,IgG2a和IgG3明顯高于IgG1和IgG2b,產(chǎn)生良好的黏膜免疫,在支氣管灌洗液中也能觀察到高水平的IgG和IgA。腹腔注射組能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平特異的IgG抗體,IgG3亞類最高,但未能觀察到IgA的增高;IgG增高的水平是口服組的2倍,IgG3增高的水平是口服組的4倍。Arnold 等〔16〕將 編 碼 Met-Ala-(His)6-OprF190-342-OprI21-83融合蛋白基因插入 pMW151、pMW209和pMW210質(zhì)粒PpagC啟動子的下游后,轉(zhuǎn)入aroA突變鼠型腸沙門氏菌減毒株SL3261,口服途徑免疫小鼠,SL3261(pMW151)可誘導(dǎo)最高水平的蛋白表達(dá),但是未能誘導(dǎo)任何可檢查到的系統(tǒng)的或黏膜的抗體;SL3261(pMW210)在小鼠的腸相關(guān)淋巴組織中有最好的感染,誘導(dǎo)中等程度的免疫反應(yīng),產(chǎn)生高水平的 IgA;SL3261(pMW209)可誘導(dǎo)高水平的IgA、IgG和IgG2a,IgG1/IgG2a分析提示以Th1型免疫反應(yīng)為主。Worgall等〔17〕將 OprF蛋白的Epi1、Epi6和Epi8 B細(xì)胞表位基因插入腺病毒5(Ad5)衣殼蛋白基因組中,成功構(gòu)建 AdZ.Epi1、AdZ.Epi6和AdZ.Epi8疫苗。用1×109pu分別免疫小鼠28 d后,AdZ.Epi8組產(chǎn)生比AdZ.Epi1和AdZ.Epi1組更高水平的抗銅綠假單胞菌IgG,再次免疫可增加7倍IgG水平。用AdZ.Epi8免疫小鼠后5 w,用致死劑量(5×105CFU)攻擊,80%的小鼠存活超過2 w,對照組存活不超過48h。AdZ.Epi8免疫不同的小鼠產(chǎn)生不同的IgG亞類,在C57BL/6小鼠主要是IgG2b;在BALB/c小鼠中IgG2b水平比IgG2a高;在 CBA鼠中 IgG亞類水平依次是IgG2a＞IgG2b＞IgG3,證明Epi8既是B細(xì)胞表位,又是T細(xì)胞表位。AdZ.Epi8免疫C57BL/6小鼠10 d后,在小鼠脾細(xì)胞中檢查到 Epi8特異性的IFN-γ增加,與對照組相比,Epi8特異性的CD4+T細(xì)胞增加18%,CD8+T細(xì)胞增加38%,證明AdZ.Epi8疫苗既誘導(dǎo)良好的體液免疫,又誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫,是有希望應(yīng)用于臨床的疫苗。

綜上所述,迄今為止還沒有真正的能阻止銅綠假單胞菌感染或能起治療作用的疫苗面世,而且?guī)缀跛械难芯渴窃趧游镏羞M(jìn)行的,少數(shù)在人體進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也不盡人意,需要進(jìn)一步研究安全性好、保護(hù)力高的疫苗。

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