劉福英

(河北醫(yī)科大學(xué) 河北省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050017)

實(shí)驗(yàn)動物皮膚病原真菌DNA快速少量提取法

劉福英

(河北醫(yī)科大學(xué) 河北省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050017)

PCR技術(shù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動物皮膚病原真菌檢測，方法簡單、省時。但是，真菌的DNA提取較為困難。本文推薦一種既簡單又經(jīng)濟(jì)快速的提取皮膚真菌DNA的方法，并能成功用于實(shí)驗(yàn)動物皮膚病原真菌質(zhì)量檢測研究。

實(shí)驗(yàn)動物;皮膚病原真菌;DNA提取

引起實(shí)驗(yàn)動物皮膚真菌病的病原菌，主要是羊毛狀小孢子菌(Microsporum lanosum)、石膏樣小孢子菌(Microsprum gypseum)和石膏樣毛癬菌(Trichonohytom mentagrophytes)，以上三種真菌是哺乳類實(shí)驗(yàn)動物必須排除的皮膚病原菌。不論是從動物皮膚病灶處或非病灶處分離到這三種菌，均視為異常。因?yàn)?，非病灶處的真菌很可能隨后引起實(shí)驗(yàn)動物真菌感染，同時對飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)成威脅。

常規(guī)的對實(shí)驗(yàn)動物皮膚真菌檢測程序主要包括，刮取動物皮毛鱗屑、沙氏培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)、菌落觀察、涂片鏡檢和報告結(jié)果。對可疑病灶，亦可刮取皮毛、鱗屑直接顯微鏡下觀察。進(jìn)而根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢特征及其生化特點(diǎn)，確定皮膚病原真菌菌種。這種方法要求檢驗(yàn)人員具有多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，熟悉掌握真菌菌種鑒別方法。由于真菌的表型特征很容易受到外界因素的影響，例如溫度變化，培養(yǎng)基和化學(xué)治療，這些都影響真菌代謝過程，尤其是皮膚癬菌的菌落易發(fā)生變異，加上檢測人員的人為因素影響，都會影響檢測結(jié)果。并且要得到典型的形態(tài)學(xué)和鏡下特征一般需要2～3周的培養(yǎng)時間。對一些缺少特異的形態(tài)及鏡下特征的菌種還需要進(jìn)行特殊培養(yǎng)基的第二次培養(yǎng)，這樣又將延遲幾個星期的時間。因此，實(shí)驗(yàn)動物皮膚真菌的傳統(tǒng)檢測方法既費(fèi)力又費(fèi)時，不能滿足準(zhǔn)確、快速的目的。

以聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)克服了表型分型的不足，在真菌的分類和診斷方面顯示出較大的優(yōu)勢和潛力。核酸檢測方法，如PCR技術(shù)，已用于微生物鑒定和診斷研究［1，2］。雖然各種絲狀真菌均能用于PCR擴(kuò)增，同時真菌DNA的提取方法不斷地改進(jìn)。然而，因?yàn)檎婢鶧NA提取的質(zhì)量關(guān)系到最終的鑒定結(jié)果，因此DNA的提取方法得當(dāng)與否，起很重要作用。到目前為止，已有多種真菌DNA提取方法，如使用破壁酶、玻璃珠法、使用研缽研磨的方法等，目的均是破壞真菌的細(xì)胞壁。如果這些方法用于大樣本量的檢測則顯示出不足和缺陷，因?yàn)镈NA的抽提過程步驟繁瑣、耗時，并且其過程中還要設(shè)法避免真菌的污染，這常使工作人員疲勞和厭倦。

實(shí)驗(yàn)動物皮膚真菌的檢測工作通常樣本量較大，需要建立一種用于PCR方法真菌檢測，快速、低耗并且獲得可靠DNA的提取方法，以減少技術(shù)人員的工作量而且縮短檢測時間。我們對照比較了幾種DNA的提取方法［3－7］的優(yōu)缺點(diǎn)，最后選擇了一種快速、小量的真菌DNA提取方法。

該方法包括以下步驟:(1)用接種針從沙氏斜面固體培養(yǎng)基刮取少量病原真菌菌絲，放入1.5mL Ep管內(nèi)，在未加入緩沖液前，用無菌牙簽的尖端貼管壁輕輕攪拌，以破壞菌絲外層細(xì)胞壁。之后，加入 500 μL 緩沖液(400mmol/L Tris-HCl pH8.0，60mmol/L EDTA pH8.0，150mmol/L NaCl，1%SDS)，用漩渦震蕩器充分混勻后，室溫靜置10 min。(2)加入150 μL 5 mol/L醋酸鉀 pH 4.8(醋酸鉀 60mL，冰醋酸11.5mL，蒸餾水 28.5mL)，簡單混勻，離心15000 r/min，1 min，上清液移至1.5mL Ep管內(nèi)，細(xì)胞碎屑及蛋白沉淀?xiàng)壢ィ貜?fù)步驟(2)一次;然后上清液移至另一個1.5mL Ep管內(nèi)。(3)加入等體積異丙醇，顛倒混勻，離心15000 r/min，5min，棄上清。(4)沉淀加入 500 μL 70%酒精，離心12000 r/min，1 min，棄上清，沉淀在室溫下晾干，約10 min，使酒精揮發(fā)，加50 μL 無菌水溶解。取1 μL用于PCR擴(kuò)增。

該方法用于實(shí)驗(yàn)動物皮膚真菌DNA的提取，整個步驟能在1 h內(nèi)完成。目前我們在對普通級和清潔級實(shí)驗(yàn)動物皮膚病原真菌檢測中，使用此方法對真菌的DNA進(jìn)行了提取，在瓊脂糖電泳中可看到清晰的DNA條帶，使用真菌通用引物做PCR能擴(kuò)增出清晰的目的產(chǎn)物［8，9］。以上結(jié)果表明這種快速、可靠、低成本的提取DNA的方法，可以用在實(shí)驗(yàn)動物的皮膚病原真菌的實(shí)驗(yàn)室研究和實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測。

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A Rapid DNA Isolation Method from Pathogenic Dermatophytes in Laboratory Animals

LIU Fu-ying
(Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

The PCR technology is used in laboratory animal pathogenic dermatophytes detection，it is a simple and time saving method.However，the fungal DNA extraction is difficult.This paper recommends a simple，rapid and economic method for skin fungal DNA extraction;also this method can be used in the quality detection of pathogenic dermatophytes in laboratory animals.

Laboratory animal;Pathogenic dermatophytes;DNA extraction

R332

A

1671-7856(2010)09-0001-02

2010-01-25

劉福英，男，教授，主要研究方向:實(shí)驗(yàn)動物管理及人類疾病動物模型。E-mail:lfy5579@126.com。