袁 偉，秦 川

(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

結核病動物模型研究進展

袁 偉，秦 川

(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，是危害人類健康的主要傳染病之一。動物模型已經(jīng)成為研究人類傳染病的標準化工具。雖然對于結核分枝桿菌而言并沒有真正意義的動物資源，但由于不同種類的動物，對分枝桿菌的敏感性不一樣，因此可以成為結核病研究的有利工具。結核病最常用的實驗動物模型包括小鼠、兔和豚鼠。每種動物有其自身特點，但并不能完全模擬人類疾病。通過建立結核病的動物模型，可以大大增加我們對疾病的病因、毒力和發(fā)病機制的理解。除了這三種模型外，非人靈長類也常被用于結核病的研究。本文總結了這幾種結核病模型的研究狀況。

結核病;模型，動物

結核病是一種傳染性疾病，它可以通過空氣傳播;只有肺結核患者才具有傳染性;每個傳染性肺結核患者，平均每人每年可以傳染10～15人;每一秒鐘全球都會有人感染結核菌;據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前全球有近1/3的人已感染結核桿菌，也就是20億人口感染了結核菌。全球有活動性肺結核病人約2000萬，每年新發(fā)結核病人約800～1000萬，每年約有300萬人死于結核?。?］。衛(wèi)生服務體系的不力，艾滋病和耐藥結核的傳播加劇了結核病對人類的威脅。據(jù)估計［2］，如果不能有效控制結核病:2000年到2020年間，將有10億人感染結核菌，2億人將發(fā)展為結核病，3500萬人將死于結核病。結核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核病人數(shù)居世界第二位。

卡介苗(BCG)是法國科學家Camille Guerin和Charles Calmette在上個世紀第一個10年中開發(fā)出來的，1921年開始應用于人類，迄今已使用了80多年。在世屆衛(wèi)生組織免疫接種擴大方案中，卡介苗作為目前唯一的結核病疫苗正在廣泛使用。接種后可預防兒童發(fā)生結核病，特別是能防止那些嚴重類型的結核病，如結核性腦膜炎。雖然所有可獲得疫苗免疫資料的Meta分析可產(chǎn)生50%的理論性保護率，但據(jù)估計卡介苗僅能預防因結核病導致所有死亡的5%。因此，抗結核病的新藥與新型疫苗的研發(fā)迫在眉睫。然而，藥物療效分析、疫苗效果評價等都離不開結核病的實驗動物模型。

1 小鼠的結核病模型

結核桿菌的發(fā)現(xiàn)者羅伯特科赫第一次使用小鼠作為實驗模型，他發(fā)現(xiàn)接種結核分枝桿菌的小鼠能誘導出與人病變一樣的自然過程。在上世紀40年代，當?shù)谝粋€有效治療結核的化療藥正在開發(fā)之時，許多研究者認識到了小鼠作為新藥成本效益評價模型的重要性。McKee等認為，用小鼠模型衡量藥物有效性比其他動物模型更為準確。在Dubos和Pierce的一系列實驗中，給以若干卡介苗亞株免疫的小鼠對結核有抵抗性［3］。Collins 和 Mackaness［4］在預防免疫和結核敏感性之間建立起聯(lián)系;而Lefford［5］建立了小鼠過繼性免疫的模型。

結核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)生長情況已經(jīng)被詳細的描述，即感染在靶器官呈現(xiàn)出特征性分布。通常采用靜脈內(nèi)注射和氣溶膠方式感染動物。結核分枝桿菌的感染過程和感染速度主要通過以下幾個因素來調(diào)節(jié):

① 細菌的毒力:這包括諸多方面，但脂質(zhì)是最為關心的，因為它們能通過感染巨噬細胞而誘導細胞因子的產(chǎn)生，并且影響其清除氧自由基的能力。

②細菌存在的臟器:肝臟中細菌的繁殖速度趕不上脾臟，它們也會感染肺臟和腎臟組織中的吞噬細胞。這些細菌僅僅在免疫活性的小鼠體內(nèi)生長，但是最終都會形成膿腫。

③接種劑量:能夠啟動小鼠體內(nèi)獲得免疫反應前的延遲時間與接種劑量成相反的關系。

④免疫反應的強度:不同品系的小鼠對結核桿菌的自然抵抗能力不同。如 CBA、DBA/2、C3H、和129/SvJ近交系小鼠高度敏感，而 BALB/c和C57BL/6小鼠高度抵抗。在一些小鼠品系中，牛型結核桿菌在肺臟中的繁殖程度不如人型。但是牛型(Ravenel)比人型(H37Rv)更容易殺死小鼠。

小鼠幾乎沒有遲發(fā)型超敏反應(delayed type hypersensitivity，DTH)，通過氣溶膠或腸外途徑感染結核桿菌并不能形成真正的干酪樣壞死，但可以引起T細胞介導的免疫反應。與其他動物相比，小鼠之所以被廣泛使用是因為價格低廉、種群數(shù)量龐大、遺傳背景清楚、免疫系統(tǒng)研究比較透徹、針對小鼠細胞因子及免疫細胞的試劑及抗體供應充足［6］。已經(jīng)有學者在人和小鼠的初始免疫反應間發(fā)現(xiàn)了相似之處［7］。例如，小鼠的巨噬細胞使用其表面的Toll樣受體來識別分枝桿菌抗原并誘導細胞因子的產(chǎn)生，而后者對肉芽腫的形成是至關重要的［8］。小鼠感染結核后肉芽腫形成的過程與人類和其他易感動物(如豚鼠)并不相同，主要是因為產(chǎn)生初始抵抗和強烈的細胞反應，進而控制了細菌的增殖和疾病的進展［9］。由于小鼠并不能形成明顯的干酪樣壞死，因此它們的肺損傷不能發(fā)展為空洞。

結核免疫主要是T細胞介導的，不能產(chǎn)生T細胞的裸鼠和嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠成為人們感興趣的動物模型。裸鼠無毛且胸腺發(fā)育不全，由于其不能產(chǎn)生功能性T細胞，因此不能抵抗結核和其他分枝桿菌的感染。聯(lián)合免疫缺陷小鼠由于缺乏T細胞和B細胞，與裸鼠一樣也不能抵抗結核和其他分枝桿菌的感染。這兩類小鼠模型常用于分離細胞群抵御分枝桿菌感染能力的檢測。去胸腺(thymectomized，TXB)小鼠是另一種動物模型:在4周大時，小鼠胸腺被移除。經(jīng)一周的恢復，小鼠被暴露于能殺死所有的分裂細胞，包括骨髓細胞的電離輻射下。由于T細胞缺陷，去胸腺小鼠對靜脈途徑感染的結核桿菌幾乎沒有抵抗力。另一種免疫缺陷形式是由于衰老而出現(xiàn)的免疫反應下降。研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量(105)的結核桿菌靜脈感染青年小鼠后，小鼠可以抑制并控制感染;但同樣劑量對于24～48月齡的小鼠來說卻是致命的。

應用小鼠模型進行結核病研究有很多優(yōu)點。和人類一樣，小鼠能產(chǎn)生強烈的免疫反應。一般來講，它們能抵制低劑量的感染并能抑制感染而不發(fā)展為活動播散性疾病。而且，它們同人類一樣，當衰老時感染很可能再次復發(fā)。但小鼠比人更能耐受結核桿菌的感染，疾病過程和病理改變明顯不同于人的結核病，小鼠的肉芽腫很難發(fā)展為干酪樣壞死和液化，而這些病理變化過程在結核患者中經(jīng)常發(fā)生。

2 豚鼠的結核病模型

在19世紀和20世紀，豚鼠是最為廣泛使用的用于感染性疾病研究的實驗動物。豚鼠和人類有許多相似之處。這些相似點對人們應用豚鼠作為感染性疾病模型產(chǎn)生了直接或間接的影響。其主要相似點在于:①像新生兒一樣，新生豚鼠擁有非常成熟的淋巴髓細胞樣復合體;②與嚙齒動物相比，其激素水平和免疫狀態(tài)更接近人類;③與人類一樣，豚鼠需要外源供給維生素C;④像人和非人靈長類動物一樣，豚鼠具有糖皮質(zhì)激素抵抗性;⑤豚鼠呼吸道生理與人驚人的相似，特別是肺部對炎癥刺激的反應。

豚鼠在生物制劑和抗結核藥物測試的實驗中被廣泛使用。它已經(jīng)成為判斷人類皮膚結核菌素效能試驗和生物制品檢定的金標準。同樣，卡介苗的發(fā)明者Camille Guerin和Charles Calmette就是主要使用豚鼠進行臨床前期測試的。豚鼠對抗結核藥物反應良好，該模型已經(jīng)成功應用于新藥和聯(lián)合用藥的測試。由于大量耐藥菌株的出現(xiàn)，豚鼠將成為新藥開發(fā)和抗結核藥物效果評定的主要模型［10］。

在過去的50多年中，豚鼠模型在幫助我們理解結核桿菌和宿主人之間關系上起了重大作用。在早期關于結核的豚鼠實驗模型研究表明，以往分枝桿菌的接觸經(jīng)常會引起遲發(fā)超敏反應和結核桿菌組織聚集的增加。隨后，許多學者致力于營養(yǎng)不良與結核抵抗力關系的研究［11］。其它關于結核桿菌與宿主吞噬細胞及分枝桿菌成分毒力潛在作用的研究也使用了豚鼠模型。

就疫苗發(fā)展而言，減少或阻止組織損傷是一重要的原則，而應用豚鼠模型就很容易做到這一點。由于豚鼠能發(fā)展成與人一樣經(jīng)典的肉芽腫而使得它們很奇特，即它們能呈現(xiàn)出 Langhans多核巨細胞，一種因巨噬細胞融合而產(chǎn)生且在人類肉芽腫中非常常見［12］。疫苗接種對于豚鼠的肺結核演進過程有重要的影響。許多疫苗在豚鼠身上都測試過，包括無活性桿菌、減毒桿菌、卡介苗的不同菌株、重組蛋白疫苗和DNA疫苗等。Jespersen認為通過皮下或皮內(nèi)注射接種較低劑量的卡介苗都是十分有效的。Palendira等推斷，卡介苗的保護作用并不依賴其接種途徑。進而，Lagranderie等認為通過氣溶膠方式接種卡介苗與腸外方式的免疫效果相當。

除了原發(fā)性肺結核外，豚鼠模型還被廣泛用于諸如結核性胸膜炎、外源性再感染、內(nèi)源性復燃等研究。氣管內(nèi)注射活卡介苗或者熱滅菌的結核桿菌能誘導豚鼠的胸膜炎。將有毒性的結核分枝桿菌通過呼吸道途徑對已經(jīng)感染過非結核分枝桿菌的豚鼠進行再次感染后，并未發(fā)現(xiàn)疾病的加重，而是像人類一樣，提供了保護作用。內(nèi)源性復燃的結核病常發(fā)生在老年人群，內(nèi)源性復燃的疾病模型將幫助我們理解結核桿菌在組織中長期存在的因素以及與之相聯(lián)系的休眠桿菌的激活和大量增殖等事件。目前，關于豚鼠內(nèi)源性復燃的資料比較有限。

豚鼠被認為是到目前為止非常好的結核病模型動物。它感染結核桿菌后造成大量組織損傷，導致廣泛的干酪化和組織壞死，發(fā)生鈣化或空洞，臨床表現(xiàn)為呼吸微弱、體重驟減，感染8～20周后死亡，與人體感染結核桿菌在肺中造成的損傷相似，因而比較好的復制了人體感染結核桿菌的病變過程。但就研究宿主的免疫反應而言，豚鼠模型相對滯后于其他動物模型，主要限制在于缺乏特異性免疫試劑。近年來，人們一直致力于豚鼠細胞因子和趨化因子的基因克隆、細胞因子和趨化因子的重組表達及豚鼠感染結核后相關免疫試劑的研發(fā)［13］。例如，研究者發(fā)現(xiàn)通過使用豚鼠單克隆抗體，在低劑量氣溶膠感染后可以肺部出現(xiàn)大量免疫細胞的集聚［14］。

3 兔的結核病模型

對于兔的結核病而言，主要是肺組織的破壞，即宿主對細菌抗原自身反應的結果。Dannenberg和Lurie通過使用兔的實驗模型對結核病進行了最為廣泛的研究。近交系兔子被用來研究結核的抵抗性和易感性。抵抗性兔子當感染具有毒力的牛型結核桿菌時會發(fā)展成與人相似的空洞型肺結核。易感性兔子或免疫低下的個體則像新生兒一樣發(fā)展成血行播散型肺結核。絕大多數(shù)商業(yè)化供給的兔子對結核桿菌都有抵抗性。因此，當感染具有毒力的牛型結核桿菌時，大多數(shù)兔子都會發(fā)展為空洞，而極少死于該病早期的血行播散。因為一般來講兔子并非近交，所以它們對結核桿菌的抵抗性存在很多變異。

兔的肺結核像人一樣有5個階段:①肺泡巨噬細胞吞噬吸入的結核桿菌;②細菌在未激活的吞噬細胞中生長;③遲發(fā)型超敏反應殺死了胞漿中聚集大量結核桿菌的巨噬細胞;④分為2種情況:在近交系抵抗性兔中，細菌從干酪樣中心邊緣逃出并在低活性巨噬細胞內(nèi)生長;或細菌從干酪樣中心邊緣逃出并不能在高活性巨噬細胞內(nèi)生長。⑤結核的固態(tài)干酪中心液化，細菌在細胞外大量繁殖，最終空洞形成。

Dorman等［15］通過氣溶膠途徑用 Erdman或H37Rv株結核桿菌分別感染近交系和非近交系新西蘭白兔并進行比較。感染后5周，近交系兔比非近交系兔有更大的肺結核灶。用H37Rv株結核桿菌感染后，近交系兔比非近交系有更多的肺結核灶且每個灶中分枝桿菌的集落形成單位也較多。將二者進行組織學比較發(fā)現(xiàn)，近交系兔有更多的干酪樣壞死，更多的活菌數(shù)量和極少的上皮細胞。因此，認為近交系兔比非近交系兔對結核更敏感。

因為兔能夠復制出人類結核病的許多特殊階段，所以它也成為了研究結核的良好動物模型之一。兔感染結核桿菌后肺部形成的肉芽腫?？砂l(fā)展為液化，易形成結核空洞，是目前可用于空洞研究的最重要動物之一。感染結核桿菌的兔發(fā)生的皮膚超敏反應可以精確地復制出人體感染后的皮膚反應，這些都顯示出兔結核動物模型的優(yōu)越性。但是，兔模型的發(fā)展正遭遇諸如相關免疫制劑的缺乏、購買成本的提高和必須在生物安全3級動物實驗室內(nèi)飼養(yǎng)等條件的制約。

4 非人靈長類結核病模型

小鼠、豚鼠和兔的結核病模型各有各的優(yōu)勢，但都不是最理想的模型。作為結核病機制研究是可行的，但由于它們和人的生理、免疫系統(tǒng)的差距，使得它們作為結核病的動物模型先天不足，尤其在新的結核疫苗的安全性及有效性評價中，這種差距顯得更為突出。非人靈長類具有與人相類似的生理特征，對結核分枝桿菌易感，能通過與人相似的感染途徑、感染方式和感染劑量等，發(fā)展成類似人的疾病特征。

Walsh等［16］報道，菲律賓食蟹猴比獼猴更能抵抗人型毒菌株的感染。通過氣管途徑給予10～100細菌量的感染，發(fā)現(xiàn)食蟹猴可發(fā)展成慢性演進的肉芽腫性疾病。結核菌素皮試有變化，但是未形成空洞。雖然食蟹猴表現(xiàn)出比獼猴更強的抵抗性，但是仍然與人的抵抗性不同。Langermans等［17］比較了卡介苗的免疫效果以及在獼猴和食蟹猴中的感染過程。他們發(fā)現(xiàn)，未受免疫的獼猴和食蟹猴表現(xiàn)出C反應蛋白的升高、結核特異性IgG抗體的升高和廣泛的空洞與干酪樣壞死形成?？ń槊鐜缀跬耆柚沽耸承泛锊±磉^程的發(fā)生，且與未免疫的猴子相比，肺部活菌數(shù)量呈對數(shù)減少。但是，獼猴并不能受到卡介苗的有效保護，因為應用卡介苗免疫的獼猴出現(xiàn)了結核病的病變過程。最近，日本學者Sugawara［18］報道了受結核感染的獼猴，應用重組卡介苗(rBCG-Ag85A)比傳統(tǒng)的卡介苗(BCG)誘導了更好的保護效果。這使得研究者們應用非人靈長類模型進行疫苗評價產(chǎn)生了巨大的興趣［19］。

DTH在非人靈長類的皮膚反應很弱。自然感染結核桿菌后，猴子的皮試陽性率很低。而使用舊結核菌素試驗，絕大多數(shù)猴子眼瞼會出現(xiàn) DTH，但一些猴子仍然會保持皮試陰性［20］。非人靈長類結核肉芽腫的組織病理學與人類相似，病灶中央為干酪樣壞死，壞死灶周圍可見大量類上皮細胞和Langhans巨細胞。而且在形成空洞的猴子中，空洞的尺寸大小不一。壞死的大空洞可浸潤到氣道，伴有結核性肺炎的出現(xiàn)。因為非人靈長類并非近交，其病理改變多種多樣且不可預測。所以，盡管人們認識到非人靈長類中空洞的發(fā)生，但在該模型中有關空洞的系統(tǒng)研究仍未開展。

非人靈長類與人類的遺傳物質(zhì)有75～98%的同源性，在生理、形態(tài)和機能上與人類十分接近，顯出了諸多與人類相似的生物學和行為學特征，成為解決人類健康和疾病問題基礎研究及臨床前研究的最理想的動物模型。

5 結語

結核動物模型在闡明結核分枝桿菌毒力基因、細菌在宿主內(nèi)持續(xù)存活的機理以及新型藥物、疫苗、診斷試劑評價方面起著重要的作用。但是，各種實驗模型都有其適用范圍，這就要求在實驗設計時選取最佳實驗模型，以取得最科學的實驗結果。隨著對結核病研究的深入，各種檢測試劑的開發(fā)，各種新的試驗技術的應用，實驗模型在結核分枝桿菌的研究中將會發(fā)揮更大的作用。

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Advance in Animal Model of Tuberculosis

YUAN Wei，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China)

Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis infection，which is one of the main infectious diseases that are harmful to human health.Animal models have become standard tools for the study of a wide array of human infectious diseases.Although there are no true animal reservoirs for Mycobacterium tuberculosis，many different animal species are susceptible to infection with this organism and have served as valuable tools for the study of tuberculosis.The most commonly used experimental animal models of tuberculosis are mouse，rabbit and guinea pigs.Each model has its own merits for studying human tuberculosis，and none completely mimics the human disease.The studies of TB in laboratory animals have significantly increased our understanding of the etiology，virulence and pathogenesis of disease.In addition to these three species，tuberculosis research has occasionally involved nonhuman primates.This review summarizes several important research model of tuberculosis.

Tuberculosis;Model，animal

R521

A

1671-7856(2010)09-0055-05

2009-12-21

袁偉(1977－)，博士生。E-mail:docyw@sohu.com。

秦川，教授，博士生導師。E-mail:chuanqin@vip.sina.com。