尚可可，張西亞，韓勝利，李國翬

（1.天津大學(xué) 精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 設(shè)備科，天津 300052；3.天津市計量監(jiān)督檢測科學(xué)研究院， 天津300192； 4.天津開發(fā)區(qū)奧金高新技術(shù)有限公司，天津 300072）

目前，全國育齡夫婦約2.3億人，不孕不育發(fā)生率在15%～20%，男性不育的發(fā)病率呈逐漸增加的趨勢,約占男女不育不孕的一半。男性不育的臨床評估和基礎(chǔ)研究的一項重要試驗是精子受孕能力檢測。

精子受孕能力是生育能力的重要指標(biāo)，由于受精過程是一個復(fù)雜的理化反應(yīng)過程，受到許多因素的影響，在實際操作中，直接測量體內(nèi)受孕能力[1-3]比較困難、成本高、方法繁瑣。而精子離體運動能力分析在某方面與精子體內(nèi)受孕能力存在著良好的相關(guān)性，因此，精子運動能力是評價受孕能力重要的指標(biāo)。

精子運動能力客觀評價方法經(jīng)歷了最初的肉眼顯微鏡觀察方法、光散射測量到計算機輔助精子運動特性分析，對精子運動能力評價越來越準(zhǔn)確、越來越客觀。本文對精子運動能力評價方法進行簡單介紹。

1 傳統(tǒng)人工精子運動能力分析

傳統(tǒng)的人工精子運動能力分析由有經(jīng)驗的醫(yī)生通過生物顯微鏡放大精液樣本圖像，觀察一定數(shù)量的精子，計數(shù)一定的時間內(nèi)精子運動經(jīng)過的距離，然后計算平均值。這種人工的計數(shù)方法主觀性強、準(zhǔn)確性低、重復(fù)性差，而且操作醫(yī)生需要經(jīng)過特殊訓(xùn)練和長期實踐。

隨后出現(xiàn)定時曝光技術(shù)，采用暗視野顯微鏡對運動中的精子進行定時曝光拍照，根據(jù)不同精子留下的軌跡長度，可以求出它們運動速度的快慢。該方法缺點是曝光時間太長、軌跡粗重、重疊后不易辯認(rèn)。如單純縮短曝光時間，精子運動的軌跡又太短，難于比較運動的差異。

為了克服定時曝光技術(shù)的問題，多次曝光技術(shù)被采用。在光源與視野之間加一個黑盤，上面有6條狹縫透光，在1s曝光時間，黑盤轉(zhuǎn)一圈，這時精子的運動軌跡就成了6個連成串的亮圓圈，克服了上述缺點。該方法在一些臨床和研究單位仍被采用。

2 激光光散射測量法

激光光散射方法是通過分析精子散射光光譜獲得精子的運動特性。激光器發(fā)射的光經(jīng)濾光片衰減后，照射精子發(fā)生光散射，根據(jù)光學(xué)多普勒效應(yīng)，精子活動速度決定散射光的光譜。通過頻譜分析，可以得到精子運動速度平均值及速度分布函數(shù)等運動指數(shù)。該方法可以無害地同時對數(shù)百個精子運動速度進行實時、在線評價，完全排除主觀因素。

宋傳琳等[4]在上世紀(jì)90年代已經(jīng)開始研究該方法，基于該方法，經(jīng)過1000多例臨床研究，證實了正常人精子運動速度平均為35μ m/s，多數(shù)不育病人的精子運動速度偏低，平均為31μ m/s，低于28μ m/s者可認(rèn)為精子活力不正常。

該方法設(shè)備簡單、技術(shù)成熟、已得到較廣泛應(yīng)用。然而，該方法只能測得精子運動指數(shù)，不能得到精子形態(tài)及運動姿態(tài)等參數(shù)。精子形態(tài)是精子的重要特征,近年來國際上非常重視人類精子的形態(tài)學(xué)分析。體外受精研究表明,正常形態(tài)精子數(shù)量與受精率呈正相關(guān),畸形精子很少能結(jié)合到卵透明帶上[5]。

3 精子動態(tài)特性計算機自動分析方法

近年來，隨著計算機技術(shù)和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，計算機輔助精子運動能力分析(CASA)方法得到迅速發(fā)展。該方法是將顯微鏡下精子圖像采集到計算機中，結(jié)合圖像處理技術(shù)，實時、在線顯示分析精子的形態(tài)和運動軌跡。在此基礎(chǔ)上計算WHO手冊規(guī)定精子曲線運動速度（VCL）、直線運動速度、精子密度、精子活率等參數(shù)[6]。通過多元方差分析獲知精子活動的模式、活力和耐力的綜合情況。

CASA方法測量結(jié)果受系統(tǒng)參數(shù)[7]、圖像采集時閾值設(shè)定[8]、圖像采集卡性能[9]、圖像處理算法[10]等因素的影響，采用該方法進行測量需要建立嚴(yán)格的取樣、操作流程，測試時溫度嚴(yán)格保持在25～35℃，精子計數(shù)板深度為8～10μ m。

為了對CASA方法客觀評價，進行了一系列對比試驗。宋傳琳等采用CASA方法與激光散射方法進行對比實驗，發(fā)現(xiàn)兩種方法測量結(jié)果有很高的相關(guān)性[11]。Rajinder S. Sidhu[12]采用CASA方法與人工觀測進行對比實驗，實驗表明：當(dāng)精子濃度低于20×106/mL時，CASA方法和人工檢測的結(jié)果偏差較大；當(dāng)樣本經(jīng)過冷凍復(fù)蘇， CASA檢測結(jié)果偏低。Mathew James Tomlinson[13]對已知濃度的模擬介質(zhì)進行實驗，結(jié)果表明：CASA檢測結(jié)果比人工檢測精度和準(zhǔn)確性要好。因此該方法為醫(yī)學(xué)臨床和科研提供了一種客觀、定量、準(zhǔn)確的測試手段[14,15]。此外，該技術(shù)還在各類動物檢測中有廣泛運用[16]。

CASA系統(tǒng)包括顯微成像部分、光電圖像轉(zhuǎn)化部分和圖像處理及分析部分。前兩部分技術(shù)較為成熟，目前研究工作主要集中在精子目標(biāo)追蹤算法及目標(biāo)識別[17]。其中，雜質(zhì)的有效識別和精子密集區(qū)的多精子跟蹤是難點。CASA系統(tǒng)使用時，雜質(zhì)包括小氣泡、環(huán)境的固態(tài)雜質(zhì)和精液自身雜質(zhì)。環(huán)境的固態(tài)雜質(zhì)和精液自身雜質(zhì)，和精子面積差別大，容易篩除，而小氣泡和精子不論面積還是圖像灰度十分接近，難于區(qū)分，最好的解決方法是采用熒光標(biāo)記的方法來區(qū)分。

CASA系統(tǒng)總體來說技術(shù)較為成熟，目前處于產(chǎn)品研發(fā)階段。各機構(gòu)在產(chǎn)品的易用性和智能性方面進行了深入研究。

4 發(fā)展展望

分子生物學(xué)研究深入和檢測技術(shù)發(fā)展，使精子檢測從宏觀向微觀發(fā)展。光譜檢測技術(shù)為監(jiān)測精子內(nèi)部成分變化提供了手段，Aleksander Giwercman[18]研究了精子活力和染色體結(jié)構(gòu)的關(guān)系，徐德祥[19]采用原子吸收光譜檢測血清和精液中硒濃度。

隨著人工授精技術(shù)發(fā)展，單個精子質(zhì)量評價越來越受矚目，采用光鑷技術(shù)[20]結(jié)合拉曼光譜對單個精子進行操控和進行分子層面的檢測成為該領(lǐng)域研究熱點。

[1]Liu DY,Baker HG. Evaluation and assessment of semen for IVF /ICSI[J]. Asia J Androl, 2002,4(4):281-285.

[2]張清健,鄭立新,田佩玲,等.染色體變異對男性生育能力影響的分析[J].中國男科學(xué)雜志,2006,20(5):13-20.

[3]Liu DY, Garrett C,Baker HG. Clinical application of spermoocyte interaction tests in invitro fertilization-embryo transfer and intracytoplasmic sperm injection p rograms[J].Fertil Steril,2004,82(5):1251-1263.

[4]宋傳琳,高洪旗,等.國產(chǎn)激光光散射測量儀和精子運動特性自動檢測系統(tǒng)在男科學(xué)研究中的應(yīng)用[J].臨床檢驗雜志,1992,10(7):1-3.

[5]王瑞雪,劉睿智.精子形態(tài)與精子功能關(guān)系研究進展[J].中華男科學(xué)雜志,2007,13(4)348-351.

[6]WHO. WHO manual for the standardized investigation, diagnosis and man agement of the infertile male [M]. London: Cambridge University Press, 2000:26-37.

[7]Ginsburg KA, Moghissi KS, Abel EL. Computer-assisted human semen analysis:sampling errors and reproducibility [J].Androl,1988,9(2):82-90.

[8]Mack SO, Wolf DP, Tash iS. Quantitation of specific parameters of motility in large numbers of human sperm by digital image processing[J].Biol Reprod,l988,38:270.

[9]Katz DF, Davis RO, Delandmeter BA, et al. Real-time analysis of sperm motion using video image digitization[J].Comp Meth Prog Biomed,1985(2l):173-l82.

[10]Davis RO,Rothmann SA, Overstreet JW. Accuracy and precision of computer-aided sperm analysis (CASA)in multicenter studies[J].Fertil Steril,1992,57(3):648-653.

[11]宋傳琳.精子動態(tài)特性自動分析檢測系統(tǒng)[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程,1993,12(1):6-12.

[12]Rajinder S. Sidhu, Rakesh K. Sharma, Jar-Chi Lee,et al.Accuracy of computer-assisted semen analysis in prefreeze and post-thaw specimens with high and low sperm counts and motility[J].Urology, 1998,51(2):306-312.

[13]Mathew James Tomlinson, Karen Pooley,et al.Validation of a novel computer-assisted sperm analysis (CASA)system using multitarget-tracking algorithms[J].Fertility and Sterility, In Press,Corrected Proof, Available online 6 February 2009.

[14]沈瑛,陳虹. 227例不育男性精子動態(tài)參數(shù)分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2006,14(2):85-86.

[15]趙立芬,許鵬,顏紅,等.精子、微生物動（靜）態(tài)圖像檢測系統(tǒng)——在生殖醫(yī)學(xué)臨床檢驗中的應(yīng)用[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程,2003,22(1):60-62.

[16]E. Rurangwa,D.E.Kime, F. Ollevier, J. P. Nash.The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.[J]Aquaculture, 2004,234(3):1-28.

[17]Lauge Sorensen, Jakob Ostergaard,Peter Johansen, et al.Multiobject tracking of human spermatozoa[J].Proc.of SPIE,2008,6914:69142c.

[18]Aleksander Giwercman, Jonas Richthoff, Henrik Hj?llundet et al. Correlation between sperm motility and sperm chromatin structure assay parameters[J].Fertility and Sterility, 2003,80(6):1404-1412.

[19]徐德祥.精液中硒含量與精子質(zhì)量和精子DNA氧化損傷的關(guān)系[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2001,35(6):54-57.

[20]BING SHAO,NASCIMENTO Jaclyn M,SHI Linda Z.Automated Motile Cell Capture and Analysis with Optical Traps[J],Methods in Cell Biology, 2007, 82:601-627.