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G蛋白偶聯(lián)受體激酶5在穩(wěn)定表達α-Synuclein的SHSY5Y細胞中的基因表達調(diào)控功能

2010-02-16 14:55王曉映代小偉徐艷峰馬春梅
中國比較醫(yī)學雜志 2010年2期
關(guān)鍵詞:細胞核細胞系帕金森病

劉 鵬,王曉映,高 寧,朱 華,代小偉,黃 瀾,徐艷峰,馬春梅,秦 川

(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京 100021)

GRKs(G protein-coupled receptor kinases)是G蛋白偶聯(lián)受體激酶,屬于絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶家族。目前發(fā)現(xiàn)GRKs的主要功能是對G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCRs)進行磷酸化,從而介導(dǎo)GPCR的脫敏反應(yīng)[1,2]。最近研究發(fā)現(xiàn)GRKs除了具有通過GPCR發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)受體激酶的作用外,還可以通過磷酸化一些非受體底物發(fā)揮作用。GRK5是GRKs家族中的一員,具有所有GRK成員的共同特點,其中包括它既可以磷酸化GPCRs,也可以磷酸化一些非受體底物,如tubulin[3],synucleins[4]和核蛋白體P2蛋白[5]等。目前根據(jù)GRK5的分布和功能確定出了一些結(jié)構(gòu)和功能域:N-末端磷脂酰環(huán)己六醇-4,5-二磷酸(PIP2)結(jié)合域,磷脂結(jié)合域(氨基酸殘基552-562),自體抑制結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基563-590),兩個鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合域(N末端氨基酸殘基20-39和C末端氨基酸殘基540-578)以及一個DNA結(jié)合細胞核定位序列(DNA-binding nuclear localization sequence,NLS)(氨基酸殘基388-395)[6-9]。

Arawaka等[10]通過對散發(fā)性帕金森病人腦組織進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn),路易小體中存在有GRK5蛋白和α-synuclein蛋白,同時發(fā)現(xiàn)GRK5具有磷酸化α-synuclein 129位點絲氨酸的功能,而αsynuclein的這種磷酸化修飾作用可能是其對多巴胺神經(jīng)元具有毒性作用的基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了GRK5在帕金森病可能具有致病作用。緊接著Bychkov等[11]發(fā)現(xiàn)GRK5的mRNA水平和蛋白水平在帕金森癡呆病人中表達均升高。由于GRK5參與了GPCRs介導(dǎo)的多種細胞信號通路的傳導(dǎo),因此GRK5的表達變化可能會導(dǎo)致帕金森病中信號傳導(dǎo)通路紊亂,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)帕金森病α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有更高表達水平的GRK5[12],在本文中我們對穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系進行GRK5蛋白表達變化的研究,并對其亞細胞水平的表達變化進行觀察。GRK5的DNA結(jié)合細胞核定位序列的發(fā)現(xiàn)[9],使人們對GRK5在細胞核內(nèi)是否具有調(diào)控功能產(chǎn)生了研究興趣。2000年,Eckhart等人[13]發(fā)現(xiàn)GRK5對一些基因的表達具有調(diào)控作用。2008年Martini等人[14]又發(fā)現(xiàn)了GRK5除了通過其經(jīng)典的磷酸化GPCR的功能外,還可以作為HDAC激酶實現(xiàn)對核內(nèi)基因的調(diào)控作用,從而參與心肌肥大疾病的發(fā)生。同年Sorriento等[15]發(fā)現(xiàn)GRK5通過增加細胞核內(nèi)IκBα,進而抑制NFκB的轉(zhuǎn)錄活性?;谝陨蠄蟮?,本文在確定帕金森病模型中GRK5蛋白表達分布變化的基礎(chǔ)上對其核內(nèi)相關(guān)功能進行了進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

Ripa蛋白裂解液(碧云天公司),Trizol試劑(Invitrogen),RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司),Realtime-PCR Master Mix(SYBR Green)(Toyobo公司),BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司),硝酸纖維素膜(Millipore公司),丙烯酰胺、N,N’-亞甲基甲叉雙丙烯酰胺和TEMED均購自北京鼎國生物公司,所有引物均由上海生工生物公司合成。GRK5抗體(Santa Cruz公司),αsynuclein抗體(Abcam公司),Bcl-2抗體(Abcam公司),HRP標記的GAPDH抗體(上海康成生物公司),羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP購自北京中杉金橋生物公司。Lipofectin TM2000 transfection Kit(Invitrogen公司),NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Pierce公司),干擾GRK5的shRNA(Open Biosystems公司),HDAC Assay Kit(colorimetric detection)(Upstate公司)。

1.2 穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系的建立

神經(jīng)母細胞瘤細胞SHSY5Y購自中國醫(yī)學科學院細胞中心,穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系由本課題組建立[16]。

1.3 ShRNA干擾

對轉(zhuǎn)染用shRNA質(zhì)粒進行提取,將所提取質(zhì)粒的測序結(jié)果與Open Biosystems公司給出的shRNA核苷酸序列進行比較,序列正確的質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后72h提取細胞總RNA和總蛋白。用real-time PCR和Western blotting對目標基因進行檢測。根據(jù)得到的實驗結(jié)果,我們從5種shRNA中選擇了抑制GRK5表達效果較好的2種shRNA進行了后續(xù)相應(yīng)的實驗。序列為:

shRNA1-GRK5:5′-CCGGACGAGATGATAGAAACAG AATCTCGAGATTCTGTTTCTATCATCTCGTTTTTT-3′;

shRNA2-GRK5:5′-CCGGCCACCACATAAACTCAAA CCACTCGAGTGGTTTGAGTTTATGTGGTGGTTTTT-3′。

1.4 蛋白提取以及Western Blotting

離心收集細胞,加入含PMSF蛋白裂解液。冰上充分裂解后4℃14 000r/min離心20min。提取上清液于即為總蛋白。利用NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents(胞漿胞核蛋白提取試劑)進行胞核和胞漿蛋白的提取,具體步驟參見說明。BCA試劑盒進行蛋白定量后,取等量樣本蛋白,加入SDS上樣緩沖液,混勻后沸水中變性,10%SDSPAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉,抗體4℃過夜雜交。次日 TBST洗膜,辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育lh,TBST洗膜,ECL顯影定影顯現(xiàn)信號。HRP標記的GAPDH抗體作為總蛋白內(nèi)參。α-tubulin以及PCNA分別作為胞漿蛋白和胞核蛋白內(nèi)參。

1.5 RNA提取以及Real-time PCR

Trizol法常規(guī)提取RNA,經(jīng)DNA酶處理后,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time PCR)進行檢測。

GRK5引物序列為:

5′-GACCACACAGACGACGACTTC-3′和5′-CGTTC AGCTCCTTAAAGCATTC-3′;

bcl-2引物序列為:5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′和5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′;

GAPDH引物序列為:5′-CATGGGT GTGAACCATGAGAGA-3′和5′-TGTGGTCATGAGTC CTTCCA-3′。

1.6 HDAC活性檢測

按照說明進行標準品稀釋,建立標準曲線(0~1mmol/L)。在樣品孔、陽性對照品孔和空白對照孔加入2×HDAC assay buffer(緩沖液),在陰性對照孔中加入4μmol/L trichostatin A,同時在陽性對照孔再加入Hela nuclear extract(核提取物)。各孔均加入4mmol/L HDAC assay substrate,充分混勻37℃孵育60min,加入activator solution(活性物溶液),充分混勻室溫孵育20min,酶標儀405nm讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達hα-synuclein SHSY5Y細胞系中GRK5的mRNA和蛋白水平均明顯增高

用real-time PCR和Western blotting分析hαsynuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞系和對照組細胞中GRK5的mRNA水平和蛋白水平的變化。圖1A顯示穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系比對照組SHSY5Y細胞具有更高水平的GRK5mRNA。圖1B顯示在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中GRK5蛋白明顯多于對照組SH-SY5Y細胞,圖示為三次獨立實驗并各重復(fù)三次的代表圖,GAPDH作為內(nèi)參。

2.2 穩(wěn)定表達hα-synuclein SHSY5Y細胞核和細胞漿中GRK5的蛋白水平均明顯增高

分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白,用Western blotting分析hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞系中GRK5蛋白表達的亞細胞分布。圖2顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中GRK5蛋白在胞漿中和胞核的表達均明顯多于對照組SHSY5Y細胞,α-tubulin作為胞漿蛋白內(nèi)參,PCNA作為胞核蛋白內(nèi)參。圖示為三次獨立實驗并各重復(fù)三次的代表圖。

2.3 hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞系中HDAC活性增強

(A)Real-time PCR的統(tǒng)計結(jié)果,**P<0.01。(B)Western blotting顯示hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞GRK5蛋白表達高于對照組SHSY5Y細胞。圖1 hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞GRK5的mRNA和蛋白的表達分析(A)The statistical results of real-time PCR.(B).Western blot analysis of total protein extracted from hα-synuclein stably transfected cells and SHSY5Y cells(control).Fig.1 Analyzing GRK5 mRNA and protein expression in hα-synuclein stably transfected SH-SY5Y cells

為了研究GRK5蛋白在細胞核中的功能,我們用HDAC assay kit對穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系的HDAC活性進行檢測,之后用shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞觀察GRK5蛋白表達抑制是否會對HDAC的活性產(chǎn)生影響。圖3A顯示與對照組SHSY5Y細胞相比,穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞的HDAC活性明顯增加,對照組SHSY5Y細胞的HDAC活性設(shè)定為100%,hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞的HDAC活性為139%。圖3B顯示shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞72h后,HDAC活性明顯低于陰性對照組SHSY5Y細胞。shRNA1-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞中HDAC活性降低約80%,shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞中HDAC活性降低約50%。與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖2 hα-Synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞核和胞漿中GRK5蛋白的增高。Fig.2 Western blotting of nuclear and cytoplastic proteins extracted from hα-syn-transfected cells and SHSY5Y cells(control).

圖3 GRK5對HDAC活性的調(diào)控Fig.3 Analysis of the histone deacetylase activity regulated by GRK5.

2.4 穩(wěn)定表達hα-synucle in的SHSY5Y細胞系中bcl-2蛋白表達增加,GRK5對bcl-2基因的表達具有調(diào)控作用

我們首先用real-time PCR和Western blotting分析穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系和對照組SHSY5Y細胞中bcl-2的mRNA水平和蛋白水平的變化。由圖4A可見穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系比對照組SHSY5Y細胞具有較低水平的Bcl-2mRNA。圖4B顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中bcl-2蛋白的表達水平明顯低于對照組SHSY5Y細胞。接著用shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞后分析bcl-2mRNA、蛋白的表達情況。圖4C顯示,shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞72h后,可見GRK5mRNA的表達明顯低于陰性對照組SHSY5Y細胞。同時,可見shRNA1-GRK5、shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞與陰性對照組SHSY5Y細胞相比,bcl-2mRNA的表達明顯增加。圖4D顯示,shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞72h后,GRK5蛋白的表達明顯低于陰性對照組SHSY5Y細胞。同時,shRNA1-GRK5、shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞與陰性對照組SHSY5Y細胞相比,bcl-2蛋白的表達明顯增加。說明GRK5的表達抑制可以促使bcl-2的表達增加。GAPDH作為內(nèi)參,圖示為三次獨立實驗并各重復(fù)三次的代表圖。*P<0.05,**P<0.01與對照相比。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系中GRK5的mRNA水平和蛋白水平均明顯增加,通過進一步檢測GRK5蛋白的亞細胞分布時發(fā)現(xiàn)無論是在細胞的胞漿中還是在細胞的胞核中GRK5蛋白表達均高于相應(yīng)的對照組細胞,這些結(jié)果提示我們GRK5蛋白的表達增加在帕金森病中可能具有一定的致病作用。

近期研究顯示GRK5中包含的DNA結(jié)合細胞核定位序列的發(fā)現(xiàn)[9],GRK5作為HDAC激酶實現(xiàn)對核內(nèi)基因的調(diào)控作用參與心肌肥大疾病的發(fā)生[14]以及GRK5通過增加細胞核內(nèi)IκBα(抑制性κBα)抑制NFκB(核因子κB)的轉(zhuǎn)錄活性[15],上述實驗結(jié)果提示我們GRK5蛋白在細胞核內(nèi)具有非常重要的作用,因此我們通過HDAC活性檢測試驗以及RNA干擾試驗對GRK5在穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞胞核中的相關(guān)功能進行了研究。我們發(fā)現(xiàn)與對照組SHSY5Y細胞相比,穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞的HDAC活性明顯增加,而且HDAC的活性隨著GRK5蛋白的表達減少而顯著降低。這些結(jié)果說明在SHSY5Y細胞中,GRK5對HDAC活性同樣具有調(diào)節(jié)作用。hα-synuclein蛋白的表達增加,可能通過增加GRK5蛋白的表達,從而抑制了HDAC的活性,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞中bcl-2的mRNA和蛋白水平都是明顯降低的,而通過shRNA干擾降低GRK5蛋白表達后,bcl-2的表達顯著增加。這一結(jié)果證實了GRK5具有對bcl-2基因轉(zhuǎn)錄和表達調(diào)控的作用,而這一作用可能是通過調(diào)控HDAC活性實現(xiàn)的。Blc-2基因表達的調(diào)控是很復(fù)雜的,最近文獻報道的GRK5可以通過增加細胞核內(nèi)IκBα抑制NFκB的轉(zhuǎn)錄活性[15],而1999年Tamatani等[17]證實NFκB可以調(diào)控bcl-2基因的表達。因此,我們發(fā)現(xiàn)的GRK5的表達增加抑制了bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,可能是由我們證實的GRK5通過影響HDAC活性進行的,也有可能是通過GRK5抑制NFκB轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)?;蜣D(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控本身就是非常復(fù)雜的,受到多種蛋白的調(diào)控,各種蛋白相互協(xié)調(diào)相互作用,共同調(diào)控,所以我們相信GRK5對bcl-2基因的調(diào)控也不僅限于這兩個方面,更多的參與此調(diào)控途徑的蛋白還有待于進一步研究。

穩(wěn)定表達hα-synuclein的SHSY5Y細胞系bcl-2的mRNA表達水平(A)和蛋白水平(B),β-actin作為內(nèi)參,圖示為三次獨立實驗并各重復(fù)三次的代表圖。shRNA1-GRK5、shRNA2-GRK5瞬時轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞以及對照組SHSY5Y細胞中GRK5和bcl-2mRNA的表達情況(C)以及蛋白的表達情況(D)。圖4 GRK5對bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達具有調(diào)控作用The detection of bcl-2mRNA(A)and protein levels(B)in hα-synuclein-expressing cells and SHSY5Y cells(control).Analysis of The mRNA level(C)and protein level(D)of GRK5 and bcl-2 in SHSY5Y cells transiently transfected with shRNA1-GRK5 and shRNA2-GRK5.Fig.4 GRK5 regulates bcl-2 gene transcription and expression

綜上所述,我們通過研究發(fā)現(xiàn)帕金森病模型中GRK5具有bcl-2基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控功能,證實了GRK5在帕金森病中具有一定的作用。這些發(fā)現(xiàn)提示我們GRK5可能作為一個新的靶點在帕金森病治療中發(fā)揮一定的作用,同時我們的發(fā)現(xiàn)為進一步研究GRKs家族的基因調(diào)控功能提供了新的研究方向。

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