趙麗亞，鮑世民，趙國際，梁銀明，李 凱，周宇荀，肖君華

（1.東華大學生物科學與技術研究所，上海 201620；2.中國科學院上海生命科學研究院實驗動物中心，上海 201615）

小鼠白內(nèi)障是一種進行性晶狀體混濁病變，當各種原因引起房水成分或晶狀體囊通透性改變及代謝紊亂，晶狀體蛋白變性，纖維間出現(xiàn)水隙、空泡、細胞上皮增值等改變，透明晶狀體變?yōu)榛鞚峒葱纬砂變?nèi)障。隨著國際小鼠基因組測序聯(lián)盟與Celera公司分別完成C57B/6J與其他三個品系（129X1/SvJ、129S1/Sv ImJ、A/J）的序列測定，為小鼠白內(nèi)障基因的研究應用奠定了良好的基礎［1，2］。迄今，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了約140個遺傳性白內(nèi)障小鼠模型，主要通過自發(fā)突變、誘發(fā)突變與敲除突變或轉基因小鼠等方式得到。通過對遺傳性白內(nèi)障基因的研究，可深入了解晶狀體病變的機制。

本文著重討論國內(nèi)外在小鼠中發(fā)現(xiàn)的白內(nèi)障致病基因突變方式、染色體上的分布及基因定位方法，并簡要總結了胚胎時期晶狀體相關重要基因的表達起始時間。

1 小鼠白內(nèi)障致病基因的突變方式

最早系統(tǒng)收集突變小鼠的方法是由30年前Kratochvilova和Ehling起始的（1979），以X-射線照射雄性親本的生殖細胞，后來這種方法發(fā)展為ENU（乙?；鶃喯趸澹┱T變［3］。

1.1 自發(fā)突變

1.1.1 無義突變：自然界中，基因自發(fā)突變產(chǎn)生白內(nèi)障的頻率很低，主要偶發(fā)自大規(guī)模飼養(yǎng)群體。偶發(fā)突變中堿基替換、堿基缺失、堿基插入等均可造成晶狀體相關基因轉錄的特異性終止，從而引發(fā)白內(nèi)障。

堿基缺失引發(fā)基因產(chǎn)物截短的小鼠白內(nèi)障最多。如2004年，英國Durham大學Sandilands等［4］報道了129X1/SvJ小鼠基因Bfsp2發(fā)生自發(fā)突變，該突變是由于Bfsp2第二個外顯子結合位點缺失，導致移碼突變，并在第三個外顯子引入終止密碼子。2008年，哈佛大學醫(yī)學院兒童醫(yī)院Matteson等［5］鑒定了C3H/HeSnJ中自發(fā)突變產(chǎn)生的空泡晶狀體（vl）小鼠，突變同時引起先天性白內(nèi)障和神經(jīng)管缺陷，定位克隆表明是Gpr161基因產(chǎn)生缺失突變，導致其編碼蛋白的C-末端被截斷。

堿基替換中G→A的轉換通常會產(chǎn)生終止密碼子。2002年，中國科學院Bu等［6］在昆明遠交系小鼠飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)一種晶狀體渾濁隱性遺傳白內(nèi)障小鼠。該突變是由于Crygs的489位發(fā)生G→A的轉換，最終形成截短的基因產(chǎn)物。

基因片段的插入往往由轉座子引起。2006年，美國Wisconsin大學醫(yī)學院Talamas等［7］在RIIIS/J品系中發(fā)現(xiàn)自發(fā)突變產(chǎn)生常染色體隱性遺傳白內(nèi)障小鼠。經(jīng)鑒定Hsf4基因在內(nèi)含子和外顯子連接的上游61bp處，在9內(nèi)含子中插入一個早期轉座元件（ETn）。ETn的插入改變了Hsf4基因的剪接和表達，產(chǎn)生截短的HSF4蛋白。

1.1.2 錯義突變：白內(nèi)障晶狀體蛋白基因產(chǎn)生突變，這種導致蛋白發(fā)生理化性質(zhì)的變化，通?？僧a(chǎn)生不正常的晶狀體纖維。1999年，美國Jackson實驗室Chang等［8］報道了隱性遺傳自發(fā)突變白內(nèi)障小鼠lop18，17號染色體上Cryaa基因第1外顯子中發(fā)生錯義突變，從而改變了晶狀體蛋白的折射性質(zhì)和透明度，最終產(chǎn)生畸形晶狀體纖維，形成白色核型白內(nèi)障。類似的包括2003年，日本Tohoku大學Okamura等［9］在DDI品系中發(fā)現(xiàn)顯性白內(nèi)障突變（CatTohm）。該突變小鼠的Aqp0基因有12bp的缺失，導致AQP0蛋白的第二跨膜區(qū)缺失4個氨基酸，晶狀體纖維細胞的嚴重退化。

自發(fā)突變還可造成晶狀體蛋白破裂。2008年，日本Shiga醫(yī)學中心研究院Omi等［10］鑒定了14號染色體上隱性基因遺傳的晶狀體破裂白內(nèi)障，由Dock5的第15個外顯子末端有27個堿基缺失引起的。在突變型和野生型中都存在Dock5基因的mRNA，但在突變型中檢測不到DOCK5蛋白，表明突變使DOCK5蛋白不穩(wěn)定。

1.2 誘發(fā)突變

通過誘發(fā)使生物產(chǎn)生大量而多樣的基因突變，短時間內(nèi)可選育出具備特殊性狀的動物模型。目前，白內(nèi)障誘發(fā)突變主要采用物理和化學誘變等方法進行。

1.2.1 物理誘變

1.2.1.1 X-射線誘變：X-射線照射可導致當代小鼠形成白內(nèi)障。晶狀體上皮細胞的輻射后受損細胞連續(xù)積累，這些細胞非正常遷移，并離開晶狀體表面部位，最終導致環(huán)境中的氧與結合性活性氧簇一起進入晶狀體中，導致晶狀體蛋白聚集，從而形成皮質(zhì)性白內(nèi)障［11］，屬非遺傳性白內(nèi)障。

當X-射線輻射較強時，可導致生殖細胞產(chǎn)生突變，得到遺傳性白內(nèi)障模型。2001年，美國賓夕法尼大學Sidjanin等［12］發(fā)現(xiàn)X-射線可導致精子基因部分缺失（76bp），得到顯性白內(nèi)障突變小鼠Hfi，雜合子小鼠表現(xiàn)為晶狀體纖維水腫，純合子小鼠則表現(xiàn)為晶狀體全混濁。X-射線亦可造成白內(nèi)障基因發(fā)生堿基替換，如Maf基因中發(fā)生堿基G→A轉換，使DNA結合區(qū)域第291位精氨酸被丙氨酸替換，產(chǎn)生粉狀白內(nèi)障的動物模型［13］。堿基替換的另一種后果可改變終止密碼子的位置，如2008年，德國化境健康研究中心Ganguly等［14］用X-射線誘變雄性小鼠，在后代得到一種顯性白內(nèi)障小鼠，該突變是由于5號染色體上crybb2基因的第5個內(nèi)含子末端發(fā)生了A-T的轉換，導致mRNA中插入57bp堿基，從而使多肽鏈增加了19個氨基酸。

1.2.1.2 γ-射線：γ-射線屬于電離輻射，易引起DNA缺失和損傷。2001年，德國Klopp等［15］用γ-射線照射親本后，后代產(chǎn)生兩側帶狀核白內(nèi)障。通過測序發(fā)現(xiàn)γ-E晶狀體編碼基因Cryge外顯子2中存在1bp堿基缺失。

1.2.2 化學誘變：ENU（乙酰基亞硝基脲）是公認的最強的小鼠誘變劑。誘變處理的雄鼠與正常雌鼠交配可在F1代篩選顯性突變或通過N2或N3代篩選隱性突變［16］。

1.2.2.1 化學誘變引起顯性白內(nèi)障：化學誘變產(chǎn)生白內(nèi)障的突變似乎多為T→A的顛換。如Graw等［17-19］用ENU誘變雄性C3HeB/FeJ小鼠，得到的顯性白內(nèi)障基因均為T→A的顛換。后來改用甲基芐肼處理親本，篩選得到的突變小鼠經(jīng)定位測序也是Crygf基因T→A的顛換［20］。同樣的，2007年，加利福尼亞大學Wang等［21］利用ENU誘變劑得到一種顯性白內(nèi)障小鼠系（L23），發(fā)現(xiàn)Crygd中發(fā)生了一個T→A的錯義突變。這就提示我們，在對化學誘變的白內(nèi)障小鼠測序時，對測序圖的檢查重點放在T→A突變上。

1.2.2.2 化學誘變引起隱性白內(nèi)障：隱性白內(nèi)障篩選的突變品系明顯少于顯性，究其原因在于隱性表型容易漏篩。2006年，加利福尼亞大學Xia等［22］利用ENU誘變劑同時得到兩種遺傳方式不同的白內(nèi)障，一種為顯性，另一種為隱性，并且是Cryaa基因在不同位置上的突變。2008年，韓國大學Kang等［23］報道了用ENU誘變得到Kec白內(nèi)障小鼠，為常染色體隱性遺傳，不過該突變基因尚未明確?？梢姡瑥拇罅康碾S機突變中通過表型篩選并鑒定點突變依然耗費時力［24］。

1.3 轉基因技術

1.3.1 轉基因小鼠：白內(nèi)障轉基因小鼠可直接錨定人類眼睛發(fā)育相關基因的網(wǎng)絡通路。如2000年，美國Albert Einstein大學Melinda等［25］將人類PAX6（5a）基因轉到小鼠中，他們通過研究PAX6（5a）在基因調(diào)控網(wǎng)絡中的作用，鑒別出一些被Pax6直接或間接調(diào)控的基因序列。Bornheim等［26］報道構建了R113C點突變轉基因小鼠系，發(fā)現(xiàn)了二個相關效應位點，可在晶狀體中引起疾病表型。

轉基因白內(nèi)障小鼠的研究還表明，晶狀體蛋白過度表達容易導致白內(nèi)障。2007年，美國芝加哥大學Chung等［27］的轉基因小鼠由雞的βB1-晶狀體蛋白啟動子驅動人類Cx50編碼區(qū)表達。結果轉基因小鼠表達Cx50蛋白的表達水平要比非轉基因小鼠高出3（13倍，從而導致轉基因小鼠形成白內(nèi)障。

1.3.2 定向敲除：發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障突變基因后，許多研究人員會對該基因進行定點敲除驗證。如2008年，中國第二軍醫(yī)大學Zhang等［28］敲除Crybb2基因，發(fā)現(xiàn)小鼠患白內(nèi)障的程度有隨著年齡越加嚴重及應激能力下降的現(xiàn)象。2009年，上海交通大學Shi等［29］報道了Hsf4敲除小鼠（Hsf4-/-）能部分模仿由HSF4突變引起的人類白內(nèi)障。HSF4對晶狀體的發(fā)育非常重要，其基因缺失至少以3種途徑導致白內(nèi)障。

當定向敲除非已知白內(nèi)障相關基因時，?？梢馔馐斋@白內(nèi)障疾病模型，表明白內(nèi)障基因受到非常復雜基因網(wǎng)絡的調(diào)控。如2008年，Jackson實驗室Ghima等［30］敲除了引起人類宮頸癌的候選基因HPV18E7。結果沒有一只小鼠形成宮頸癌，但是所有的轉基因小鼠都形成了皮質(zhì)性白內(nèi)障。同樣的例子在肌肉僵硬性敲除模型中發(fā)現(xiàn)［31］。

2 白內(nèi)障相關基因的分布與基因定位方法

2.1 白內(nèi)障相關基因的分布

白內(nèi)障具有高度的遺傳異質(zhì)性，任何與晶狀體發(fā)育和分化有關的基因突變都可形成遺傳性白內(nèi)障。，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)每條染色體上都有與白內(nèi)障相關的基因，其中以1號染色體的基因突變最多，尤以Cryg基因家族為最，已知的突變位點多達24個（http://www.informatics.jax.org/javawi2/servlet/WIFetch?page=markerQF）。根據(jù)NCBI中的信息，我們繪制了20條染色體上已知白內(nèi)障基因的分布圖（圖1）。

2.2 基因定位方法

2.2.1 全基因組掃描：基因組掃描是指對基因組中DNA多態(tài)性標記逐個進行篩查，基因組掃描的關鍵是計算所需遺傳位標的個數(shù)。一般認為72只F2代患病白內(nèi)障小鼠僅需要46個STR（short tandem repeat）位點用于基因定位［32］。對于顯性遺傳性白內(nèi)障小鼠，若某位點純合基因型占患病樣本的比率低于25％，即為連鎖［17］，從而確定該基因在染色體上的粗略位置。

2.2.2 單倍型分析確定候選基因：針對白內(nèi)障基因所在染色體區(qū)段，繼續(xù)挑取STR位點進行精細定位，用單倍型進行分析，從而將致病基因定位在較小的區(qū)域，挑取染色體區(qū)段內(nèi)已知的白內(nèi)障基因為候選基因［17］，并對候選基因進行測序確定白內(nèi)障基因突變位點。

圖1 小鼠白內(nèi)障基因在染色體上的分布Fig.1 The distribution of mouse cataract genes on chromosomes

3 白內(nèi)障相關基因的表達時間

晶狀體發(fā)育早期易受轉錄因子的基因影響，如Maf家族是亮氨酸鏈（bZIP）的轉錄因子，主要在晶狀體纖維早期發(fā)育和分化階段表達，是晶狀體球蛋白基因調(diào)控的中樞，在胚胎期10.5d到胚胎期11.0d之間的小鼠眼睛中檢測到Maf的起始表達，該基因的突變極易引發(fā)先天性白內(nèi)障［33］，其他轉錄因子包括Pax6［34］，Pitx3［35］，或Sox［36］等基因突變也會引發(fā)先天性白內(nèi)障。如果晶狀體結構蛋白連接蛋白（connexins）［3，37，38］、內(nèi)源性膜蛋白（MIP）［38］，晶狀體內(nèi)源性膜蛋白（Lim-2）［38］或晶狀體纖維細胞液結構蛋白（晶狀體結構蛋白）［33，39］開始表達，其突變就會直接影響晶狀體的發(fā)育，形成白內(nèi)障。以上描述的晶狀體相關基因表達時間如圖2所示，不一一贅述。

圖2 胚胎時期晶狀體發(fā)育相關基因轉錄啟動時間Fig.2 Transcription start-up time of the lens development-related genes during embryonic period

4 結論與展望

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界約有4 500萬人失明，其中有一半是由白內(nèi)障導致［40］。由于先天性白內(nèi)障疾病的復雜性，目前的研究還遠遠不夠，距離真正了解這一疾病還有很大距離。為了解更多白內(nèi)障發(fā)展進程、致病因素，為白內(nèi)障個體化診治闡明更明確的各類白內(nèi)障致病機制，尋找各種合適的動物模型就顯得尤其重要。

通過對眾多白內(nèi)障相關基因的網(wǎng)絡調(diào)控研究與詳細的表型分析，將使我們更深入了解眼睛發(fā)育的通路。因此，所有對這些突變的詳細分析均是十分必要的，能使我們更清楚的描述白內(nèi)障致病機理。從而使得白內(nèi)障疾病成因的復雜調(diào)控網(wǎng)絡得以更加明晰。

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