朱 焱，王祿增，楊 威，于 洋，王 維，董婉維，汪 瑛，秦 英，鄭志紅

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)市公安醫(yī)院，沈陽(yáng) 110001）

STK15基因是絲/蘇氨酸激酶家族成員之一［1］。STK15基因是一種與中心體結(jié)構(gòu)及功能緊密相關(guān)的基因，并具有高水平的酪蛋白激酶活性［2］。STK15基因的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)使中心體異常擴(kuò)增，從而導(dǎo)致染色體的異常分配及不穩(wěn)定，最終癌基因激活，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生［3］，所以STK15的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生存在一定的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒，并將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3，觀察STK15高表達(dá)對(duì)NIH3T3細(xì)胞的影響，以進(jìn)一步闡明STK15基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基、TR IZOL均購(gòu)自Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、回收試劑盒均購(gòu)自Qiagen。限制性?xún)?nèi)切酶、TaqE、dNTP、連接試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa。小牛血清購(gòu)自天津?yàn)?。兔抗人STK15多克隆抗體購(gòu)自AbD Serotec。HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗購(gòu)自中山公司。S-P試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。MTT購(gòu)自華美公司。重組人基底膜購(gòu)自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-STK15：提取人胚肺細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增STK15cDNA全長(zhǎng)，克隆到pTZ57R/T載體，測(cè)序。BamH1和XbaI雙酶切pcDNA3.1和T-STK15連接產(chǎn)物，回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，構(gòu)建pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（PcDNA3.1、PcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞）接種于6孔板，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h。

1.2.3 RT-PCR：提取細(xì)胞RNA，RT-PCR試劑盒檢測(cè)STK15的表達(dá)，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為498bp。

1.2.4 Western印跡分析：PBS洗2次，裂解液冰上孵育30min，12 000r/min，4℃離心30min，上清液即細(xì)胞蛋白。然后加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1∶500的兔抗人的STK15多克隆抗體，室溫震蕩2h，洗膜3次，加入1∶2 000的山羊抗兔的二抗，室溫震蕩1h，洗膜3次，顯色。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞傳代于有載玻片的六孔板中，次日取出玻片，固定30min。加過(guò)氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10min，PBS洗3次。封閉，室溫下孵育10min，甩去血清。加一抗（兔抗人STK15抗體1：500稀釋?zhuān)?℃、過(guò)夜，PBS洗3次。加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育10min，PBS洗3次。加鏈霉素—過(guò)氧化物酶溶液（D），室溫下孵育10min，PBS洗3次。加DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染30s，返藍(lán)，50％甘油封片。

1.2.6 MTT方法：每孔3 000個(gè)細(xì)胞（NIH3T3細(xì)胞、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞、pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞）接種于96孔板，在24、48、72h加入MTT（終濃度5mg/mL），37℃、孵育4h，棄上清，加入DMSO 150μL，低速震蕩10min，分光光度計(jì)490nm讀取A值。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，共重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室法：人工基底膜膠冰浴過(guò)夜融化，用預(yù)冷的無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液1：5稀釋?zhuān)?00μL包被于Trans well小室濾膜上，置5％CO2、37℃、培養(yǎng)24h。上室接種轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞（約2.5×104個(gè)細(xì)胞）100μL，下室加入10％FBS的DMEM 600μL作為趨化因子，置5％CO2、37℃、培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，濾膜用多聚甲醛固定15min，蘇木素染核，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR

轉(zhuǎn)染后48h，pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組擴(kuò)增出498bp目的基因片段，而pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組未能擴(kuò)增出片段（圖1）。

2.2 STK15的蛋白表達(dá)

與轉(zhuǎn)染空載體組相比，STK15轉(zhuǎn)染組在48h后可檢測(cè)到STK15蛋白表達(dá)的上調(diào)。（圖2）

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)

藍(lán)色為蘇木素染色的細(xì)胞核，棕紅色為DAB標(biāo)記的STK15蛋白表達(dá)陽(yáng)性區(qū)，表明STK15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（圖3.3）大部分STK15蛋白表達(dá)陽(yáng)性，pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組（圖3.2）和普通NIH3T3細(xì)胞（3.1）中，沒(méi)有STK15蛋白表達(dá)（圖3見(jiàn)彩插2）。

2.4 MTT檢測(cè)

轉(zhuǎn)染STK15質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖在48、72h顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。（圖4）

2.5 Transwell結(jié)果

用平均穿膜細(xì)胞數(shù)標(biāo)化成相對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖（圖5）。STK15轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為258.45±4.95，而NIH3T3細(xì)胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞分別為20.50±4.65和21.00±5.56，，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別 =276.00、38.47，P＜0.05）。

M：DL2000；1：陰性對(duì)照；2：N IH3T3細(xì)胞中STK15mRNA的表達(dá)；3：pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組STK15mRNA的表達(dá)；4：pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組 STK15mRNA的表達(dá)；5：陽(yáng)性對(duì)照。圖1 STK15mRNA在轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)M：DNA markerDL2000；1：Negative control；2：Product of STK15 in NIH3T3 cells；3：Product of STK15 transfected by pcDNA3.1；4：Product of STK15 in the cells transfected by pcDNA3.1-STK15；5：Positive control.Fig.1 Expression of STK15 mRNA in the pcDNA3.1-STK15-transfectN IH3T3 cells

1：NIH3T3細(xì)胞STK15蛋白的表達(dá)；2：pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組STK15蛋白的表達(dá)；3：pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組STK15蛋白的表達(dá)圖2 Western blot檢測(cè)STK15蛋白表達(dá)1：Product of STK15 of N IH3T3 cells；2：Product of STK15 of cells transfected by pcDNA3.1；3：Product of STK15 of cells transfected by pcDNA3.1-STK15；1：Product ofβ-actin ofN IH3T3 cells；2：Product ofβ-actin of cells transfected by pcDNA3.1；3：Product oβf-actin of cells transfected by pcDNA3.1-STK15Fig.2 The results of STK15 protein expression assayed byWestern blot

圖4 兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的MTT檢測(cè)情況Fig.4 MTT test results of the cells from two groups measured at different times

圖5 體外跨室趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組及NI H3T3細(xì)胞比較Fig.5 Comparason of the results of Transwell test of the pcDNA3.1plas mid-transfected cellsandpcDNA3.1-STK15 plasmid transfected cells，and N I H3T3 cells.

3 討論

近年來(lái)腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤與基因異常密切相關(guān)。STK15基因是有絲分裂器的基本調(diào)控蛋白，在中心體調(diào)節(jié)、紡錘體形成、染色體分離、胞質(zhì)分裂，即有絲分裂的正常進(jìn)行中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。它的過(guò)表達(dá)可引起中心體擴(kuò)增，染色體不穩(wěn)定，非整倍體的形成而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［4］。

本實(shí)驗(yàn)表明，體外轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)?？梢杂行У厥筍TK15在NIH3T3細(xì)胞中高表達(dá)，說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖速率明顯高于對(duì)照組（p＜0.05）說(shuō)明STK15基因可以使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度加快，進(jìn)而形成細(xì)胞的惡性增殖，誘發(fā)腫瘤；Katayama等［5］發(fā)現(xiàn)抑制STK15的表達(dá)可致細(xì)胞分裂停滯于G2/M交界點(diǎn)附近，認(rèn)為STK15可磷酸化p53蛋白，促進(jìn)了Mdm2介導(dǎo)的p53蛋白泛素化及降解，減弱了p53介導(dǎo)的細(xì)胞有絲分裂監(jiān)視點(diǎn)機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖加快；還有人發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞G2/M轉(zhuǎn)換與STK15磷酸化另一下游抑癌基因產(chǎn)物-BRCA1蛋白有關(guān)，認(rèn)為對(duì)細(xì)胞G2/M轉(zhuǎn)換同樣是必需的［6］；以上結(jié)論最終說(shuō)明STK15基因的過(guò)表達(dá)使細(xì)胞增殖速度加快。

本實(shí)驗(yàn)采用Trans well小室檢測(cè)STK15對(duì)細(xì)胞體外侵襲力的影響，癌細(xì)胞要穿透人工基底膜和直徑只有8μm的聚碳酸酯微孔濾膜，需要降解Matrigel成分。而且穿透Matrigel膜涉及細(xì)胞的粘附、基質(zhì)降解和移動(dòng)3個(gè)過(guò)程，這與在人體內(nèi)的浸潤(rùn)繼而轉(zhuǎn)移過(guò)程完全相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒組的細(xì)胞穿透Matrigel基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而且質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出比對(duì)照組高20倍以上的跨膜運(yùn)動(dòng)能力，充分表現(xiàn)出了STK15的高表達(dá)可以提高NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力和腫瘤化能力。綜合以上兩點(diǎn)，我們認(rèn)為將STK15基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞提高了NIH3T3細(xì)胞的增殖速度和體外侵襲能力，這可能是形成腫瘤發(fā)病機(jī)制之一。

鑒于STK15基因與惡性腫瘤的關(guān)系如此密切，不少研究者已經(jīng)將STK15基因作為研制抗腫瘤新藥的靶子。各種能抑制STK15基因的擴(kuò)增、表達(dá)及其生物學(xué)活性的物質(zhì)已成為大家研究的焦點(diǎn)。Tong等［7］人將特異性抑制STK15基因表達(dá)的外源性siRNA體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人的食管癌細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后48h和72h轉(zhuǎn)染siRNA的人食管癌細(xì)胞的侵襲能力明顯低于未轉(zhuǎn)染的人食管癌細(xì)胞的侵襲能力。Hamada等［8］用STK15基因和STK15反義基因轉(zhuǎn)染B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)STK15反義基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系增殖率更低，并且停頓于G1期的細(xì)胞明顯增多，此外抑制細(xì)胞增殖的程度與反義寡核苷酸的濃度成正比。隨著研究的深入，STK15基因必將為惡性腫瘤的治療提供新的有效手段，對(duì)今后癌癥的早期診斷和早期治療均具有重要的臨床意義。

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