王曉琳，于生元，姜 磊，董 釗，王曉輝，周志斌

（中國人民解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853）

偏頭痛是一種臨床上常見的慢性、復(fù)發(fā)性腦功能異常所致的原發(fā)性頭痛。到目前為止，偏頭痛的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，主要有血管源性學(xué)說、三叉神經(jīng)血管學(xué)說、皮層擴(kuò)布性抑制學(xué)說等。針對(duì)不同機(jī)制建立的多種偏頭痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用于偏頭痛的發(fā)病機(jī)制、藥物治療、行為學(xué)觀察等研究中。

硬腦膜是顱內(nèi)主要的傷害性感受組織，在偏頭痛的發(fā)病過程中起著重要的作用。硬腦膜神經(jīng)源性刺激模型作為三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說所反映的病理生理過程的典型代表，特別是電刺激上矢狀竇附近硬腦膜模型，目前被廣泛運(yùn)用于偏頭痛的發(fā)病機(jī)制、藥物治療等方面的研究［1］。電刺激硬腦膜使得腦膜血管擴(kuò)張加上擴(kuò)張后釋放炎癥介質(zhì)激活了分布于硬腦膜上的三叉神經(jīng)終末感受器，傷害性信息沿三叉神經(jīng)節(jié)、脊束核、丘腦傳遞至皮層，產(chǎn)生痛覺，同時(shí)激活的三叉神經(jīng)脊束核逆向調(diào)節(jié)神經(jīng)終末釋放血管活性物質(zhì)，進(jìn)一步增強(qiáng)了傷害性信息，使疼痛在程度和時(shí)間上都有所增加［2］。然而，目前使用的該模型基本上是建立在動(dòng)物麻醉基礎(chǔ)上的，對(duì)給予刺激的幅度大小主要靠對(duì)動(dòng)物實(shí)時(shí)心臟、血壓、呼吸等方面的監(jiān)測來反映［3］。

即使不考慮模型制備的復(fù)雜性，模型模擬的真實(shí)性上也存在明顯的問題。因?yàn)槠^痛的患者不可能在麻醉的情況下發(fā)病，麻醉不但可以減輕疼痛的程度，也會(huì)減少劇烈疼痛可能引發(fā)的情感及自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。因此，我們實(shí)驗(yàn)室建立了一種清醒狀態(tài)下電刺激上矢狀竇硬腦膜觀察動(dòng)物行為學(xué)改變的偏頭痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并從動(dòng)物行為學(xué)、血液流變、對(duì)嗎啡的反應(yīng)等方面進(jìn)行了驗(yàn)證。為了進(jìn)一步明確該模型在給予相應(yīng)電刺激后腦內(nèi)的激活情況我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠30只，體重225～250g。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（電刺激）、對(duì)照組（假手術(shù)）和正常組（空白），每組各10只。實(shí)驗(yàn)組以臺(tái)式牙鉆顱骨鉆洞暴露SSS后，安放電極并給予方波電流刺激2h；對(duì)照組除不給予電流刺激外所有操作同實(shí)驗(yàn)組；正常組在麻醉后直接處死。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（雄性SD大鼠，SCXK（京）2006-0009）。

1.2 動(dòng)物模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10％水合氯醛（0.4mL/100g，解放軍總醫(yī)院）腹腔內(nèi)注射麻醉后，剪掉頭正中部毛發(fā)，固定于立體定位儀上。消毒并逐層切開皮膚、筋膜及骨膜以暴露顱骨。臺(tái)式牙鉆在顱骨上鉆直徑約1mm圓孔，取點(diǎn)方法為顱中線冠狀縫交點(diǎn)前4mm后6mm，暴露上矢狀竇硬腦膜。將金屬電極的兩極分別置于刺激孔的硬腦膜上，并用牙科水泥固定。75％酒精消毒切口及皮膚周圍后縫合皮膚，將大鼠置于原環(huán)境中靜養(yǎng)，期間給予抗生素喂食（阿莫西林膠囊，按30mg/kg與食物混合喂食，3/日），環(huán)境中保持安靜，室溫在25℃左右。大約4～5d后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠給予電刺激。采用日本光電工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)的刺激器（SEN-7103）和分離器（SS-102J）給予電刺激2h（Duration=50，Intervel=250）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后灌注固定動(dòng)物。以上所有操作均保證無菌條件，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)要求進(jìn)行。

1.3 灌注固定及染色

所有動(dòng)物以致死量10％水合氯醛腹腔注射麻醉，插管至左心室，先以100mL生理鹽水沖洗血液，再給予500mL含4％多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）灌注固定。灌畢立即取腦，置于上述新鮮固定液中后固定4h，再移入含30％蔗糖的PBS中至組織塊沉底（4℃）。將大鼠腦組織用恒溫切片機(jī)作連續(xù)冠狀切片，切片厚度25μm，切片隔2張取一張，分3套收集。

第1套切片行免疫組織化學(xué)染色，具體步驟：①切片放入小鼠抗Fos血清（1：500；Chemicon）室溫下孵育18～24h；②生物素標(biāo)記的二抗室溫下孵育4h；③辣根過氧化酶標(biāo)記得鏈霉卵白素室溫下孵育30min；④二氨基聯(lián)苯胺（DAB）中呈色，邊反應(yīng)邊觀察，待免疫陽性細(xì)胞呈棕色時(shí)以蒸餾水終止反應(yīng)。上述抗體和復(fù)合物的稀釋液均用含0.3％的Triton X-100和0.5％正常羊血清的PBS，各步驟間用PBS徹底清洗片子。最后將切片脫水透明封片并進(jìn)行觀察。

第2套切片用于正常小鼠血清的孵育，后續(xù)的反應(yīng)過程同上，進(jìn)行替代對(duì)照試驗(yàn)。第3套切片進(jìn)行Nissl染色，用以對(duì)照觀察和定位免疫組織化學(xué)染色的陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

鏡下切片背景為棕黃色，F(xiàn)os免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈深棕黃色或深褐色，形狀呈卵圓形或橢圓形，直徑在5～8um之間，與以往報(bào)道相同［4］。

實(shí)驗(yàn)組Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元在腦內(nèi)分布較廣泛，主要集中的高頸段脊髓后角、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核、中縫核簇、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、腳間核、下丘腦、丘腦等部位。其中，高頸段脊髓后角、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核、中縫核簇、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的數(shù)量較多，與以往研究報(bào)道類似［5］。而對(duì)照組的Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元在形態(tài)上與實(shí)驗(yàn)組一致，但在分布位置和數(shù)量上存在明顯差別：主要分布在中腦導(dǎo)水管周圍，數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組明顯下降；在高頸段脊髓后角和三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核僅有零散分布?？瞻捉M未發(fā)現(xiàn)Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元。

圖1 fos陽性神經(jīng)元中腦導(dǎo)水管Fig.1 fos-immunoreactive neurons in the aqueduct（Aq）

圖2 fos表達(dá)部位的示意圖（The rat brain 5th.Paxinos andWatson）.Fig.2 Drew pictures showing the distribution of fos-immunoreactive neurons.Each black dot indicates 3 positive neurons.

3 討論

即刻早期基因c-fos和它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Fos蛋白作為細(xì)胞功能活動(dòng)狀態(tài)的標(biāo)志，常常被用于機(jī)能與形態(tài)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究［6］。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，胞核內(nèi)的c-fos基因mRNA轉(zhuǎn)移至胞漿并翻譯為Fos蛋白，對(duì)該蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色可以間接的反應(yīng)機(jī)能相關(guān)的細(xì)胞在腦內(nèi)的分布。但是這種方法的特異性較弱，F(xiàn)os蛋白對(duì)刺激反應(yīng)敏感，任何刺激（光、溫度、機(jī)械或其他刺激）都可以引起表達(dá)。因此，在進(jìn)行用Fos免疫組織化學(xué)染色時(shí)需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，盡量減少外界非特異性刺激，同時(shí)進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以保證結(jié)果的特異性［7］。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果所呈現(xiàn)的Fos陽性神經(jīng)元與既往研究一致。與麻醉狀態(tài)下進(jìn)行的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Fos染色結(jié)果有差異［8］，除了報(bào)道的高頸段脊髓后角、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核外和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外，尚有中縫核簇、腳間核、下丘腦和丘腦等部位也觀察到了分布密集的Fos陽性神經(jīng)元。

我們都知道疼痛的三級(jí)神經(jīng)元傳遞機(jī)制：即被根節(jié)（三叉神經(jīng)節(jié)）-脊髓后角（三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核）-丘腦-皮層。作為疼痛初級(jí)中樞，脊髓后角、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核外和丘腦在有傷害性信息傳遞時(shí)細(xì)胞呈活躍狀態(tài)是可以理解的［9］。由于頭面部的感覺支配主要是由高頸段和三叉神經(jīng)的分支，所以在電刺激硬腦膜所致的偏頭痛模型中，高頸段脊髓后角、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核和丘腦出現(xiàn)Fos陽性神經(jīng)元，從形態(tài)學(xué)角度說明該模型有效模擬了頭面部的疼痛。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在對(duì)疼痛自行調(diào)節(jié)的兩個(gè)下行系統(tǒng)：即內(nèi)源性下行抑制系統(tǒng)和易化系統(tǒng)［10］。目前的研究認(rèn)為兩者均起源于PAG，并經(jīng)由中縫核簇和藍(lán)斑、藍(lán)斑下核介導(dǎo)后分布在延髓和脊髓后角，完成其對(duì)傷害性信息的調(diào)控。在偏頭痛的研究過程中，發(fā)現(xiàn)在人的PAG植入電極并加以刺激可以誘導(dǎo)出偏頭痛樣發(fā)作［11］；由于血管性或炎性病變等破壞PAG可使原本沒有頭痛的病人罹患偏頭痛樣頭痛［12］；神經(jīng)影像學(xué)檢查提示偏頭痛發(fā)作時(shí)PAG部位代謝活躍，血流增加，各種證據(jù)證明PAG在其發(fā)病和后續(xù)病理生理改變中擔(dān)任了重要角色［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，PAG和中縫核簇內(nèi)分布了大量的Fos陽性細(xì)胞，說明在刺激后這些部位的神經(jīng)元激活，符合上述研究結(jié)論，但激活后的功能尚需進(jìn)一步的研究。

腳間核屬于邊緣系統(tǒng)，對(duì)其在功能上的認(rèn)識(shí)曾有報(bào)道其參與疼痛、情緒等方面的調(diào)節(jié)，但具體還不是很清楚。下丘腦是一個(gè)非常重要的皮質(zhì)下中樞，是自主神經(jīng)系統(tǒng)的最高中樞，控制著機(jī)體血壓、心率、呼吸、體溫、胃腸道等，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和平衡起著重要作用。同時(shí)，下丘腦還參與調(diào)控周期性情感，有研究認(rèn)為下丘腦功能障礙是抑郁癥發(fā)病的機(jī)制之一［14］。我們知道在偏頭痛的發(fā)生過程中，一般伴隨有惡心、嘔吐、大汗、心慌等自主神經(jīng)反應(yīng)，并且慢性偏頭痛的患者往往伴有抑郁、焦慮等負(fù)面情緒甚至病癥，因此在治療時(shí)推薦同時(shí)抗抑郁或焦慮治療，而且復(fù)合治療比單純治療的效果滿意。本實(shí)驗(yàn)中得到的這一結(jié)果尚未見有類似報(bào)道，麻醉狀態(tài)下的Fos表達(dá)并未涉及中腦以上部位，但是由于腳間核和下丘腦在自主神經(jīng)控制、情感調(diào)節(jié)方面功能，所以該結(jié)果對(duì)偏頭痛的研究是有意義的，可能參與了偏頭痛發(fā)作時(shí)伴隨癥狀的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)清醒狀態(tài)下電刺激大鼠上矢狀竇硬腦膜模型大鼠的腦內(nèi)Fos蛋白表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從結(jié)果來看激活腦區(qū)主要在高頸段脊髓后角、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核、中縫核簇、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、腳間核、丘腦和下丘腦等部位，從形態(tài)學(xué)角度評(píng)估了該模型，為進(jìn)一步的功能及藥物研究提供了基礎(chǔ)。

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