(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院,江蘇南京,210029)

小兒骨科臨床工作中會面臨較多的由于軟骨破壞、軟骨缺損而帶來的一系列問題。關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管的組織,依靠關(guān)節(jié)液營養(yǎng),一旦損傷,自我修復(fù)能力有限,治療困難。近年來由于骨組織工程學(xué)的興起,為臨床軟骨缺損的修復(fù)帶來了希望。其主要內(nèi)容包括種子細(xì)胞的選擇、支架材料的應(yīng)用和培養(yǎng)環(huán)境的構(gòu)造三個(gè)方面[1]。其中種子細(xì)胞的獲得及培養(yǎng)是整個(gè)組織工程學(xué)的基礎(chǔ)。因此選擇一種具有多向分化能力、免疫原性低、來源廣的種子細(xì)胞顯得尤為重要。但細(xì)胞來源問題成了組織工程技術(shù)的一個(gè)難題?，F(xiàn)在可以成功的應(yīng)用擴(kuò)增培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞、擴(kuò)增軟骨細(xì)胞形成的類似軟骨組織和生物材料技術(shù)通過體內(nèi)移植的方式修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨[2]。然而,研究結(jié)果表明這種方法并不是很理想:一是由于供體組織和供體部位病變的限制,二是無法獲得所需要的大量的軟骨細(xì)胞,三是在體外培養(yǎng)時(shí)軟骨細(xì)胞會向成纖維細(xì)胞分化[3]。另一方面,來自于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞已被證實(shí)可以在不同的誘導(dǎo)方法下向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞方向分化[4]。在體外試驗(yàn)中,高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞在已知成分培養(yǎng)基中可以被誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞方向分化[5]。將間充質(zhì)干細(xì)胞和成熟的軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)不僅解決了誘導(dǎo)信號問題也解決了細(xì)胞來源問題。本實(shí)驗(yàn)中,作者將間充質(zhì)干細(xì)胞和成熟軟骨細(xì)胞在體外混合培養(yǎng)并分析相關(guān)的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 人間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng):髖關(guān)節(jié)骨盆截骨術(shù)中所截取的股骨,采用全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs,用咬骨鉗剪成碎塊然后用吸管反復(fù)吹打,使骨塊中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞充分溢出,500 r/m in離心6min,棄上清,加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,100 U/m L青霉素及100 g/m L鏈霉素),反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液;以每毫升2×104個(gè)細(xì)胞接種培養(yǎng)瓶,37℃,5%CO2,飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。4 d后首次全量換液,棄去大量的懸浮細(xì)胞,以后隔1d換液。待細(xì)胞長滿單層后,用0.025%的胰蛋白酶消化以1∶2傳代(圖1)。

1.1.2 兔軟骨細(xì)胞的培養(yǎng):2～3月齡的健康白兔,體質(zhì)量2～2.5 kg,雌雄不限。無菌條件下取髖關(guān)節(jié)軟骨,PBS反復(fù)洗滌去掉血污,仔細(xì)剝離附著的滑膜、纖維組織,剪碎組織至1 mm×1 mm大小,加入4m L 0.0 5%的Ⅱ型膠原酶消化30min,離心去上清,加入0.1%的Ⅱ型膠原酶3m L和0.25%的胰酶3m L 37℃振蕩消化60～100 min,肉眼見消化液渾濁,將消化后的小軟骨塊均勻貼在25 cm2培養(yǎng)瓶下壁,加入少量含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的完全培養(yǎng)基(含青霉素100U/m L,鏈霉素100 mg/L),將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)放置在培養(yǎng)箱內(nèi)20～30min,待小軟骨塊貼牢培養(yǎng)瓶下壁后,加入5 m L完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),1周后換液,以后每周2次換液。當(dāng)細(xì)胞增殖到鋪滿培養(yǎng)瓶底的80%～90%后傳代。加入1m L 0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化,為了加快消化速度可以邊消化邊晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,在顯微鏡下觀察,當(dāng)70%貼壁細(xì)胞被消化下來時(shí)(約1m in),加入2m L培養(yǎng)基終止消化,用吸管吹打2～3次使細(xì)胞完全脫落下來成為單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后離心,按1∶2 或 1∶3傳代(圖2)。

1.1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng):將收集到的第3代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和第2代間充質(zhì)干細(xì)胞先用含0.15%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS液沖洗1次,再用無血清培養(yǎng)基沖洗,然后將細(xì)胞混懸于含 50 mg/m L ITS+Premix(6.25 μg/m L胰島素,6.25μg/m L轉(zhuǎn)鐵蛋白,6.25 ng/m L硒酸,1.25 mg/m L苯磺酸和5.35 mg/m L亞油酸)100μg/m L丙酮酸鹽、50μg/m L抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽、10 U/L地塞米松和10μg/m L TGF-β3的高糖DMEM 培養(yǎng)液中。以5種不同的比率進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(見表1):間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng),間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分別以1∶2、1∶1、2∶1的比例培養(yǎng),關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)胞混合后放入15 m L聚丙烯試管中37℃,5%CO2培養(yǎng),每周換液3次,4周后用PBS液沖洗后用福爾馬林固定。

表1 間充質(zhì)干細(xì)胞和兔軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)比例(105)

1.2 RNA的抽提與real-time PCR

TRIZOL法抽提總RNA,進(jìn)行濃度和純度測定后M-M LV法逆轉(zhuǎn)錄為c-DNA。PCR反應(yīng)體系為:2×PCRMaster Mix 12.5μL,cDNA模板1μL,上下游引物各1μL,加水至終體積2 5μL。cbfa 1的擴(kuò)增條件為 :9 5℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)30次,最后72 ℃延伸7 min;βactin的擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 m in;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)26次;最后72℃延伸7 min。取5μL PCR產(chǎn)物,2.0%瓊脂糖/溴化乙錠凝膠電泳。UVP凝膠密度掃描儀及其分析軟件進(jìn)行半定量分析。以18 s rRNA為內(nèi)參,行相對定量比較,引物序列如下:

2 結(jié) 果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞形態(tài)(圖1、2)

2.2 混合培養(yǎng)中的細(xì)胞比例

采用人類特異性β2微球蛋白引物,同時(shí)針對人和兔共有序列18 s rRNA設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增,以單獨(dú)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞為對照計(jì)算不同混合比例試驗(yàn)組中β2微球蛋白與18 s rRNA的相對比例。在開始階段,在混合培養(yǎng)的試管中β微球蛋白基本沒有變化,經(jīng)過4周的培養(yǎng)后這種比例沒有明顯的變化(圖3),這表明兩種細(xì)胞的增殖比例接近相同。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞 40倍

圖2 軟骨細(xì)胞 40倍

圖3 共培養(yǎng)中細(xì)胞比例的變化

2.3 混合培養(yǎng)試管中的軟骨細(xì)胞表型

用Ⅱ型膠原與Ⅰ型膠原表達(dá)的比例來估計(jì)軟骨細(xì)胞表型,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明在軟骨細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞比例為1∶2、1∶1和2∶1的試管中Ⅱ型膠原與Ⅰ型膠原表達(dá)的比例分別為:1.71、0.72、0.63、0.50, 在最初的培養(yǎng)中 Ⅱ型膠原與Ⅰ型膠原表達(dá)的比例隨著間充質(zhì)干細(xì)胞百分比的增加而降低。在經(jīng)過四周的培養(yǎng)后這種比例分別增加至2.39、1.12、1.42、1.81,見圖4。在混合培養(yǎng)中間充質(zhì)干細(xì)胞比例高的樣本其Ⅱ型膠原與Ⅰ型膠原表達(dá)的比例增高,高比例的間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)Ⅱ型膠原的表達(dá)。

圖4 Ⅱ型膠原與Ⅰ型膠原的比例隨時(shí)間變化的規(guī)律

2.4 Ⅱ型膠原、β2微球蛋白、總Ⅱ型膠原、SOX9的表達(dá)

人特有的Ⅱ型膠原在人間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)表達(dá)增加,人特有的β2微球蛋白是人間充質(zhì)干細(xì)胞的特異標(biāo)志,在經(jīng)過四周的培養(yǎng)后,在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中幾乎沒有人特有的Ⅱ型膠原表達(dá),而人特有的β2微球蛋白的表達(dá)是明顯的(圖5),這表明人間充質(zhì)干細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯的向軟骨細(xì)胞方向分化的現(xiàn)象?？偄蛐湍z原和SOX9基因是軟骨形成的標(biāo)志,在實(shí)驗(yàn)中總Ⅱ型膠原的表達(dá)增加(圖6),SOX9的表達(dá)隨著混合比例的增加而增加(圖7),表明了軟骨形成增加。

圖5 β2微球蛋白的表達(dá)

3 討 論

組織工程學(xué)要求提供獨(dú)立的自體細(xì)胞,多數(shù)用于組織修復(fù)的自體細(xì)胞使用的是健康調(diào)查的活組織檢查提供的或者用動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。這些方法的缺點(diǎn)是很明顯的:可獲得的細(xì)胞數(shù)量非常有限,有創(chuàng)途徑會造成供體部位的損害而增加了以后發(fā)生股關(guān)節(jié)炎的可能性,而且在體外擴(kuò)增時(shí)會發(fā)生去分化的現(xiàn)象,限制了其的臨床應(yīng)用[6]?，F(xiàn)在更多的研究集中在多能干細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞的組織再生。從骨髓分離的間充質(zhì)干細(xì)胞有分化成不同的細(xì)胞表型的多向分化能力并且可以在不同的誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下向不同的表型分化[7]。參與MSCs向軟骨分化過程的生長因子有多種:TGF-β、BMP、IGF。它們的作用不盡相同,有的單獨(dú)誘導(dǎo)軟骨形成,有的促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),有的維持軟骨細(xì)胞的表型。

細(xì)胞通訊系統(tǒng)賦予一種組織可以有幾種相似的細(xì)胞功能,例如細(xì)胞新陳代謝的調(diào)節(jié)。細(xì)胞通訊系統(tǒng)不僅對同一組織的同種細(xì)胞起作用,而且可以通過細(xì)胞間隙對不同的細(xì)胞起作用[8]。在成骨細(xì)胞生成過程中細(xì)胞通訊系統(tǒng)和旁分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo),并且協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境來適應(yīng)外環(huán)境的變化[9]。有研究表明,從成熟軟骨組織獲得的軟骨細(xì)胞擁有細(xì)胞間隙功能[10]。

圖6 總Ⅱ型膠原的表達(dá)

圖7 SOX 9的表達(dá)

所有這些表明離體的軟骨細(xì)胞有很大的可能性給予或接收來自間充質(zhì)干細(xì)胞的信號,如果將間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞混合培養(yǎng)在一個(gè)能夠相互作用的環(huán)境,那么這種培養(yǎng)方法將有可能成為軟骨修復(fù)工程中一種非常有用的方法,在我們的實(shí)中,我們用β2微球蛋白相對表達(dá)量與不同比例人間充質(zhì)干細(xì)胞變化的相關(guān)性驗(yàn)證了人間充質(zhì)干細(xì)胞和兔軟骨細(xì)胞能夠共存并在四周的培養(yǎng)期內(nèi)保持最初的混合比例。因此,試管中軟骨表型的變化不是根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)變化而變化。如先前描述的那樣所有試管培養(yǎng)中都有明確的軟骨形成介質(zhì)。單獨(dú)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞沒有表現(xiàn)出任何明確的向軟骨細(xì)胞方向分化的信號。有報(bào)告表明,間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后逐漸喪失向軟骨細(xì)胞分化的潛力,第3代和第8代細(xì)胞向軟骨方向分化能力最強(qiáng)[11]。本組選用的第3代干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出明顯的向軟骨細(xì)胞分化的現(xiàn)象。RT-PCR分析人類Ⅱ型膠原蛋白在任何一個(gè)試管中均未檢測到,而人特有的β2微球蛋白的表達(dá)是明顯的,這表明間充質(zhì)干細(xì)胞并不是直接向軟骨方向分化。Ⅱ型膠原蛋白和軟骨基質(zhì)形成的增加可能是由于間充質(zhì)干細(xì)胞對軟骨細(xì)胞的正反饋調(diào)節(jié)。軟骨細(xì)胞再分化和去分化需要一個(gè)三維立體的環(huán)境和生長因子來增強(qiáng)其分化效率[12]。已有研究報(bào)告FGF-2能夠維持軟骨分化能力,同時(shí)TGF-β、IGF-1、BMP-2能夠正反饋調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)的形成。這些生長因子在間充質(zhì)干細(xì)胞單層培養(yǎng)中能夠持續(xù)分沁或者是在軟骨形過程中分沁開始增加。以前的研究證明SOX 9在軟骨細(xì)胞形成時(shí)表達(dá)增高[13]。實(shí)驗(yàn)中SOX9基因和總Ⅱ型膠原的表達(dá)隨著間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞比例的增加而增加,這表明在共培養(yǎng)時(shí)軟骨形成增多。結(jié)合以上的結(jié)果,一個(gè)可能的機(jī)制是在共培養(yǎng)當(dāng)中間充質(zhì)干細(xì)胞以間接的旁分沁的方式影響軟骨細(xì)胞形成和正向調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的表達(dá)。

間充質(zhì)干細(xì)胞和兔軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)正反饋調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的表達(dá),增加了軟骨細(xì)胞形成。這種共培養(yǎng)方法適用于在體外擴(kuò)增成熟軟骨細(xì)胞并且不會降低他們的分化能力。在以前的研究中沒有觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞之間的這種誘導(dǎo)區(qū)別,下一步的研究有必要用原始間充質(zhì)干細(xì)胞或自體細(xì)胞系統(tǒng)分析這種效應(yīng)。

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