馬俊芬,李 沛,黃幼田,楊洪艷,鄭智敏,董子明

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1953年生,博士,教授,研究方向:腫瘤發(fā)病機制及生物治療,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是一種組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDAC)抑制劑,能抑制組蛋白去乙?；傅幕钚浴Ｋ軌蛲ㄟ^改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài),從而選擇性地調(diào)控腫瘤相關(guān)基因,已成為一種新的腫瘤治療制劑[1-2]。TSA對腫瘤的抑制作用可以表現(xiàn)在以下幾個方面:細胞周期的阻滯,誘導(dǎo)凋亡及抑制血管增生。為了解 TSA對食管癌EC1細胞凋亡的影響,作者進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 RPMI 1640(美國Gibco公司),胎牛血清(天津TBD生物有限公司),TSA(美國Sigma公司),Annexin V-FITC試劑盒(江蘇碧云天生物公司),Bax鼠抗人單抗及Bcl-2兔抗人單抗(美國Santa Cruz公司),食管癌EC1細胞(香港大學(xué)曹世華教授惠贈)。

1.2 細胞培養(yǎng) EC1細胞在含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,然后分為 4組,實驗 1、2及 3組分別用含 0.3、0.5和1.0μmol/L TSA培養(yǎng),對照組用0.44 g/L的DMSO培養(yǎng)。

1.3 流式細胞儀檢測凋亡細胞 分組作用 24 h后,收集細胞上清,用 0.5 g/L胰蛋白酶消化細胞,細胞懸液與上清液合并,離心,制備單細胞懸液,進行細胞計數(shù)。取至少 106個細胞移入新的 1.5 mL EP管中,190μL冰預(yù)冷 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞,加10μL Annexin V-FITC輕輕混勻,室溫避光放置10min,1 000 r/min離心5min,棄上清,加入195μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞,加入5μL PI,室溫避光孵育10m in。另設(shè)未染色管、單染Annexin V-FITC管及單染PI管;以未染色管調(diào)零機器,以Annexin VFITC單染管和PI單染管作為基準參照,測定每個上樣管數(shù)據(jù),利用CellQuest 3.0軟件進行參數(shù)獲取和資料分析,計算凋亡細胞百分比。

1.4 Western Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達分組作用 24 h后,按照細胞總蛋白試劑盒說明提取總蛋白,Bradford法檢測蛋白質(zhì)的含量,50μg上樣量,用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用50 g/L牛血清白蛋白封閉3 h,分別加入Bax和Bcl-2一抗,4℃過夜。將膜放于TBST稀釋的二抗中,室溫輕搖2 h,用TBST洗滌3次,使用HRP-ECL發(fā)光法顯影,結(jié)果用Gel-Doc圖像分析軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。4組細胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達的比較行單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni法,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細胞凋亡率測定結(jié)果 與對照組相比,實驗1組細胞的凋亡率無明顯變化,隨著TSA濃度升高,實驗 2、3組細胞凋亡率呈增加趨勢,見表 1。

2.2 4組細胞Bax、Bcl-2表達的變化 與對照組相比,0.3μmol/L TSA處理后EC1細胞促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達無明顯變化,0.5μmol/ L TSA處理后EC1細胞Bax的表達增加,而Bcl-2的表達減少,1.0μmol/L TSA處理后EC1細胞Bax的表達增加和Bcl-2表達減少更明顯。見圖1,表1。

圖1 4組細胞Bax和Bcl-2蛋白的表達

表1 4組細胞凋亡率(n=5)及Bax和Bcl-2蛋白表達(n=3)的比較

3 討論

TSA源自鏈霉菌代謝產(chǎn)物,是一種強效HDAC抑制劑。HDAC抑制劑通過活化凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進凋亡相關(guān)蛋白的表達,誘導(dǎo)細胞凋亡。與細胞凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括死亡受體和線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Fas、FasL及TRAIL是主要蛋白,Insinga等[3]研究表明HDAC抑制劑丙戊酸可以通過選擇性上調(diào)白血病細胞中Fas、FasL及TRAIL的表達,從而活化死亡受體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。HDAC抑制劑還可以調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達和亞細胞定位,活化線粒體凋亡信號通路而誘導(dǎo)細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是一類調(diào)控細胞凋亡的蛋白,主要分為兩大類:一類包括Bax、Bid、Bcl-xs等含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白,這些蛋白形成同源二聚體,嵌在線粒體膜上,通過增強線粒體膜通透性,促進細胞色素c(Cytc)和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)的釋放,誘導(dǎo)細胞凋亡;另一類是抗凋亡蛋白,包括Bcl-xL和Bcl-2,這些蛋白過表達后與Bcl-2家族中的促凋亡蛋白結(jié)合形成異源二聚體,從而阻斷Cytc和AIF的釋放,抑制細胞凋亡[4]。

作者分別用0.3、0.5、1.0μmol/L TSA培養(yǎng)細胞24 h,用Annexin V-FITC和PI雙染色流式細胞儀檢測EC1細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,與對照組比較,0.3μmol/L TSA處理24 h后細胞凋亡率沒有明顯變化,0.5μmol/L TSA處理后EC1細胞凋亡率增加;隨著TSA作用濃度的增加,Bax的表達量增加,而Bcl-2則減少。表明TSA可以引起促凋亡基因蛋白Bax表達上調(diào)和抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào),從而引起EC1細胞凋亡,其機制可能為:一方面TSA可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達水平,使線粒體膜的通透性增強而活化線粒體凋亡信號通路[5-7];另一方面TSA通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的亞細胞定位誘導(dǎo)細胞凋亡,這種作用和細胞質(zhì)中DNA末端識別和結(jié)合蛋白Ku70蛋白密不可分,Ku70可與Bax結(jié)合,抑制Bax向線粒體膜的轉(zhuǎn)運。TSA促進Ku70的乙?；?使其釋放與之結(jié)合的Bax[8]。Bax轉(zhuǎn)運到線粒體膜上,形成同源二聚體,增強線粒體膜的通透性,引起Cytc的釋放,誘導(dǎo)EC1細胞的凋亡。Bax既可以自身形成同源二聚體,又可以與 Bcl-2結(jié)合成異源二聚體并定位于質(zhì)膜上,Bcl-2與Bax的結(jié)合是Bcl-2發(fā)揮作用的前提。當 Bax在細胞內(nèi)過量表達,形成同源二聚體增多,破壞了Bcl-2與Bax的結(jié)合。與Bax分離的Bcl-2失去抗凋亡能力,使細胞對死亡信號的反應(yīng)增強。

總之,TSA作用EC1細胞后可以通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達和亞細胞定位兩個方面,活化線粒體凋亡信號通路,誘導(dǎo)細胞凋亡[9],但是否還與其他基因的表達改變有關(guān)尚有待進一步研究。

[1]Marks PA,Miller T,Richon VM.Histone deacetylases[J]. Curr Opin Pharmacol,2003,3(4):344

[2]Habold C,Poehlmann A,Bajbouj K,et al.Trichostatin A causes p53 to switch oxidative-damaged colorectal cancer cells from cell cycle arrest into apop tosis[J].J Cell Mol Med,2008,12(2):607

[3]Insinga A,MonestiroliS,Ronzoni S,etal.Inhibitors of histone deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death receptor pathway[J].Nat Med, 2005,11(1):71

[4]Zhao LY,Niu Y,Santiago A,etal.An EBF3-mediated transcriptional program that induces cell cyclearrest and apoptosis[J].Cancer Res,2006,66(19):9 445

[5]Kang MR,Kang JS,Han SB,et al.A novelδ-lactam-based histone deacetylase inhibitor,KBH-A 42,induces cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2009,78(5):486

[6]李云龍,鄒小明,袁友萍,等.曲古菌素 A對胃癌細胞系BGC-823組蛋白H 4乙酰化水平及細胞凋亡的作用[J].腫瘤學(xué)雜志,2008,14(8):654

[7]Woo HJ,Lee SJ,Choi BT,et al.Induction of apop tosis and inhibition of telomerase activity by trichostatin A,ahistone deacetylase inhibitor,in human leukemic U937 cells[J]. Exp Mol Pathol,2007,82(1):77

[8]Subramanian C,Opipari AW Jr,Bian X,et al.Ku70 acetylation mediates neuroblastoma cell death induced by histone deacetylase inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(13):4 842

[9]Ahn MY,Lee J,Na YJ,etal.Mechanism of apicidin-induced cell cycle arrest and apoptosis in Ishikawa human endometrial cancer cells[J].Chem Biol Interact,2009, 179(2/3):169