王瓊?cè)~,侯桂琴,王莉莉,薛樂(lè)勛

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤細(xì)胞生物研究室鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物研究室鄭州 450001

#通訊作者,男,1942年2月生,教授,研究方向:腫瘤與生物工程,E-mail:xuelx@371.net

細(xì)胞生長(zhǎng)要受到高度復(fù)雜和精密的調(diào)控,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控過(guò)程中起重要作用,是細(xì)胞生長(zhǎng)的中心調(diào)控因子[1]。以 m TOR為中心構(gòu)成的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[1-3]表明,mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)與增殖中起中心調(diào)控作用,它所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與多種惡性腫瘤有關(guān),已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin,rapa)是新型大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物,對(duì)前列腺癌、乳癌及胰腺癌等惡性腫瘤均有一定療效[4]。mTOR信號(hào)通路在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中是否起作用以及rapa是否對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)增殖有抑制作用,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。作者采用免疫組化 SP法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中mTOR的表達(dá)情況,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rapa對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響,為食管鱗狀細(xì)胞癌的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細(xì)胞來(lái)源 HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;mTOR(sc-8319)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司;rapa、碘化丙啶(PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RNase購(gòu)自大連寶生物公司,Annexin VFITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。EC9706細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 標(biāo)本來(lái)源 取2001年 1月 1日至 2006年 8月 1日在安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院胸外科行初次手術(shù)且有完整臨床病理資料的食管鱗狀細(xì)胞癌組織石蠟標(biāo)本50例,均經(jīng)病理檢查確定診斷。男 30例,女 20例,年齡 49～67歲,中位年齡 58歲;術(shù)前均未接受過(guò)化療及放療。以來(lái)自食管癌病發(fā)區(qū)無(wú)癥狀人群食管活檢組織 15例(男 9例,女 6例,年齡40～59歲,中位年齡47歲)作為陰性對(duì)照。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)中生長(zhǎng),并置于37℃,體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.4 食管鱗狀細(xì)胞癌及正常食管組織中m TOR蛋白的檢測(cè) 石蠟切片標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水,嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說(shuō)明操作,DAB顯色。mTOR一抗工作濃度1:50。選擇5個(gè)視野(×400)的1 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察。結(jié)果判定[5]:胞漿中有清晰棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。著色強(qiáng)度計(jì)分:陰性為 0分;弱為1分;中等為2分;強(qiáng)為3分。著色分布計(jì)分:未著色為0分;10%～為1分;51%～為2分; 90%～100%為 3分。著色樣式計(jì)分:未著色為 0分;零星著色為1分;聚集著色為 2分;彌散著色為 3分。結(jié)果取 3項(xiàng)計(jì)分之積:0分為陰性,≥1分為陽(yáng)性。

1.5 細(xì)胞周期測(cè)定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分別用20、50和100 nmol/L rapa處理,24 h后收集細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液,用體積分?jǐn)?shù)為 70%冷乙醇固定,4℃過(guò)夜。約106個(gè)細(xì)胞移入離心管中,PBS洗3次,加入RNase室溫消化1 h,然后加入碘化丙啶(PI)染液,染色30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組中靜止期(G0/G1)、合成期(S)、合成后期和分裂期(G2/ M)的細(xì)胞比例。用未處理細(xì)胞作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分別用20和50 nmol/L rapa處理,24 h后收集細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液,用 100μL冰預(yù)冷 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,將試管置于冰上;加5μL Annexin V-FITC和2.5μLPI到100μL的細(xì)胞懸液中,輕輕混勻;將試管置于冰上,室溫避光孵育15 min;加入400μL 1×結(jié)合緩沖液,輕輕混勻,在 30 min內(nèi)分析結(jié)果,以凋亡試劑處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,未處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照。以未染色細(xì)胞調(diào)零機(jī)器,以Annexin V-FITC單染管和PI單染管作為基準(zhǔn)參照,測(cè)定每個(gè)上樣管數(shù)據(jù),利用CellQuest3.0軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析,計(jì)算 I區(qū)(繼發(fā)死亡細(xì)胞區(qū)),Ⅱ區(qū)(早期凋亡細(xì)胞區(qū))和Ⅲ區(qū)(活細(xì)胞區(qū))的細(xì)胞百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析,食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管組織中mTOR的表達(dá)采用χ2檢驗(yàn),各組細(xì)胞周期分布和凋亡率的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管組織中mTOR的表達(dá) mTOR主要在胞漿中表達(dá)(圖1)。m TOR在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為 64.0% (32/50),較正常食管組織的13.3%(2/15)高(χ2= 11.873,P=0.001)。

圖1 正常食管組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中m TOR的表達(dá)(SP,×400)A:正常食管組織;B:食管鱗狀細(xì)胞癌組織。

2.2 rapa對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響 見(jiàn)表2。

表2 不同濃度rapa對(duì)EC 9706細(xì)胞周期的影響(n=10) %

2.3 rapa對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表3。

表3 不同濃度rapa對(duì)EC 9706細(xì)胞凋亡的影響 %

3 討論

mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增生、分化等過(guò)程中起重要作用,與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[6]。mTOR在多種腫瘤中被顯著激活而促進(jìn)腫瘤發(fā)生,并且mTOR可直接使p70S6K磷酸化(p-p70S6K),pp70S6K促翻譯活性高出未磷酸化p70S6K 100倍左右,從而促進(jìn)蛋白合成[7],抑制此通路可以使細(xì)胞周期停滯,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生[8]。研究[9-10]顯示rapa衍生物及其細(xì)胞周期抑制劑779對(duì)前列腺癌、乳癌、胰腺癌等惡性腫瘤的良好的抗腫瘤作用。

目前針對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌中mTOR信號(hào)通路的研究較少,該研究著重探討食管鱗狀細(xì)胞癌中mTOR信號(hào)通路的狀態(tài)以及rapa是否抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,從而為食管鱗狀細(xì)胞癌的靶向治療尋找有效的藥物。該研究通過(guò)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示mTOR蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常食管組織高,提示mTOR通路在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中處于激活狀態(tài),下一步的研究將通過(guò)檢測(cè)mTOR下游靶蛋白來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該通路的激活狀態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:不同濃度rapa處理組滯留在G0/G1期的細(xì)胞比例高于未處理組,提示rapa可使細(xì)胞滯留在G1期,從而抑制細(xì)胞的增殖;同時(shí)處于Ⅱ區(qū)(早期凋亡細(xì)胞區(qū))的細(xì)胞比例處理組高于未處理組,提示rapa誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是rapa的促凋亡機(jī)制是否因?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)期處于 G1期而觸發(fā)了凋亡還有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,該研究初步探討了食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的可能分子機(jī)制即m TOR信號(hào)通路的激活在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用,而mTOR的抑制劑rapa可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡,從而為靶向治療食管鱗狀細(xì)胞癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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