馮 婷,趙明耀,孫麗莎,李 沛,馬俊芬,黃幼田,董子明

鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1953年4月生,教授,研究方向:腫瘤病因發(fā)病學、免疫及生物治療,E-mail:dongziming@zzu.edu.cn

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)因其具有強大的抗原提呈能力和誘導初始T淋巴細胞活化的能力,被認為是體內(nèi)最有效的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC),是識別病原侵入的第一道防線。盡管機體的免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答,但許多腫瘤細胞仍然能在機體內(nèi)生長,這是因為機體內(nèi)存在腫瘤的免疫逃逸機制。宿主體內(nèi)DC的異常變化是腫瘤免疫逃逸機制的一個重要方面[1-2]。其中包括DC的數(shù)量減少、功能低下或缺陷。因此,如何提高DC的數(shù)量和增強其功能成為腫瘤治療的一個重要方面。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharides,ABPS)是從牛膝根中分離的一種小分子水溶性多糖化合物,具有抗腫瘤、抗衰老、細胞毒和多種免疫調(diào)節(jié)作用[3]。目前有關ABPS對免疫功能的影響有較多的研究[4],但是未見其抗腫瘤作用是否與DC有關的報道。為此,作者進行了如下研究,探討其抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器和試劑 6～8周齡雄性昆明小鼠,體質(zhì)量 20～24 g,購自河南省實驗動物中心。人食管癌EC9706細胞株由鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室常規(guī)傳代培養(yǎng)。流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司),RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司),重組小鼠粒細胞巨噬細胞刺激因子(rmGM-CSF,杭州隆基生物技術有限公司),重組小鼠白細胞介素-2、-4(rmIL-2、rmIL-4,美國Perprotech公司),PE標記的抗小鼠CD11a單克隆抗體、FITC標記的抗小鼠CD86單克隆抗體(Ebioscience公司),熒光染料CFSE(Alexis公司),ABPS (山東泰安醫(yī)藥有限公司)。

1.2 小鼠骨髓源性 DC的誘導培養(yǎng)[5-6]頸椎脫臼法處死小鼠,無菌條件下提取小鼠骨髓細胞,用 37℃預溫的Tris-NH4Cl紅細胞裂解液去除紅細胞,再用GKN緩沖液離心洗滌3次后,加入含100mg/L的青霉素和鏈霉素、體積分數(shù)為 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(含10μg/L rmGM-CSF,5μg/L rm IL-4)調(diào)細胞密度至5×106mL-1,以1m L/孔接種于24孔培養(yǎng)板。置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后棄去懸浮細胞,半量換液。于培養(yǎng)第 3天培養(yǎng)液中加入低、中和高質(zhì)量濃度的ABPS(200、300及400 mg/L),設生理鹽水對照組,以后隔日全量換液并補充ABPS。每組均設4個復孔。于第 5天負載 EC9706制備的凍融腫瘤抗原(鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室傳代培養(yǎng)保存)。用倒置顯微鏡每天觀察細胞的生長狀況,通過形態(tài)學變化觀察其成熟情況。

1.3 DC表面標記CD86和CD11a的檢測 細胞培養(yǎng)及分組方法同 1.2。于培養(yǎng)第 8天收集懸浮DC,PBS洗2次,分別加入FITC標記的CD86和PE標記的CD11a單克隆抗體各20μL,混勻放至4℃冰箱孵育30min,再用PBS洗2次,加1m L 40 g/L多聚甲醛固定 30 min,流式細胞儀檢測CD86和CD11a的表達。

1.4 DC細胞周期的流式細胞術檢測 細胞培養(yǎng)及分組方法同 1.2。于培養(yǎng)第8天收集另一部分懸浮DC,PBS洗2次,加入體積分數(shù)為70%乙醇4℃冰箱過夜,離心后棄乙醇,PBS洗,加入100μL RNA酶,輕輕吹勻,37℃水浴放置 30 min。再加入 100 μL碘化丙啶(PI)染料,4℃避光孵育30min后上流式細胞儀檢測。DC增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/ G1+S+G2/M)×100%。

1.5 DC致敏的T淋巴細胞增殖指數(shù)檢測 細胞培養(yǎng)及分組方法同 1.2。處死小鼠后無菌取其脾臟,研磨成單細胞懸液,用37℃預溫的Tris-NH4Cl紅細胞裂解液去除紅細胞,再用GKN緩沖液離心洗滌3次,用體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(含5μg/L rm IL-2)調(diào)細胞密度至5×107m L-1,培養(yǎng)6 h后收集未貼壁的T淋巴細胞。收集第8天的DC后經(jīng)以上方法培養(yǎng),與小鼠脾T淋巴細胞以 1:50的比例混合培養(yǎng) 3 d后收集T淋巴細胞,用流式細胞術檢測細胞周期。T淋巴細胞增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.6 DC誘導的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性檢測 細胞培養(yǎng)及分組方法同 1.2。收集傳代培養(yǎng)的EC9706細胞,用CFSE進行染色,以經(jīng)DC刺激的T淋巴細胞為效應細胞,EC9706細胞為靶細胞,效靶比為20:1,混合培養(yǎng)6 h,用流式細胞術檢測T淋巴細胞的殺傷活性[1]。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理,應用單因素方差分析比較不同組別 DC表面CD86、CD11a的表達、DC增殖指數(shù)、T細胞增殖指數(shù)及CTL殺傷活性等有無差異,用SNK-q檢驗進行兩兩比較,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ABPS和FTA沖擊對小鼠DC形態(tài)的影響培養(yǎng)至第5天,ABPS中劑量組可見大部分細胞有突起伸出,并有大量的突起交織在一起,為典型的DC形態(tài)(圖 1);低劑量組、生理鹽水對照組僅有少量突起伸出,高劑量組細胞數(shù)量減少且突起不明顯。用FTA沖擊后培養(yǎng)至第7天,ABPS中劑量組細胞突起減少,由貼壁、半懸浮狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài),細胞變大變圓,均勻散布于培養(yǎng)基中;低劑量組和生理鹽水對照組懸浮的細胞少于中劑量組,多于高劑量組。

圖1 ABPS對小鼠DC形態(tài)的影響(倒置顯微鏡,×250)

2.2 ABPS和FTA沖擊對DC表面CD86及CD11a表達的影響 見表1。

表1 ABPS和FTA沖擊對DC表面CD 86及CD 11a表達的影響

2.3 ABPS和FTA沖擊對DC增殖指數(shù)、DC致敏T細胞增殖指數(shù)及DC誘導的EC9706 CTL的殺傷活性的影響 見表2。

表2 ABPS和FTA沖擊對DC增殖指數(shù)、DCs致敏T細胞增殖指數(shù)及DC誘導的EC 9706 CTL的殺傷活性的影響

3 討論

DC作為功能強大的APC,在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用,但是由于腫瘤組織產(chǎn)生的活性物質(zhì)會抑制DC,使荷瘤宿主體內(nèi)存在的DC出現(xiàn)功能缺陷而無法有效地遞呈腫瘤抗原,進而無法激活 T細胞去識別和殺傷腫瘤細胞。因此,如何有效地促進機體DC細胞的增殖與成熟是目前腫瘤免疫治療研究的重點之一。

多糖屬于天然的免疫功能生物調(diào)節(jié)劑,也是一類新型高效低毒的抗腫瘤藥物。有研究[2]顯示 ABPS具有抗腫瘤作用,但其抗腫瘤作用是否與 DC有關,目前未見有關報道。

作者的實驗結(jié)果表明ABPS在異源性抗原負載的條件下可以促進DC的分化、成熟及促進小鼠DC表面分子CD11a、CD86的表達;增強DC刺激T細胞的活化能力;增強DC誘導的CTL對EC9706細胞的殺傷能力。這是因為多糖本身可以作為生物信號調(diào)節(jié)分子結(jié)合到DC細胞的CR 3、TLR 2、TLR 4、Dectin-1或甘露糖受體上,其中DC相關C型凝集素-1是葡聚糖的主要受體[6]。ABPS的化學組成中主要有葡萄糖、甘露糖和果糖 3種單糖組分,由D-β-果糖組成,屬果聚糖,組成比為果糖:葡萄糖 8: 1[3]。ABPS作用于相應DC的受體,啟動細胞的增殖、分化和功能信號通路,使 DC的生物學效應增強。另外ABPS可促進集落刺激因子(CSF)、TNF-α與IL-2等細胞因子的分泌,產(chǎn)生類似的增強效應。

作者的研究結(jié)果還顯示,ABPS中劑量組對DC表面CD86和CD11a的表達、DC增殖指數(shù)、DC致敏T細胞增殖指數(shù)及DC誘導的EC9706 CTL的殺傷活性均優(yōu)于生理鹽水對照組和高、低劑量組;且高劑量組各項指標明顯下降,甚至低于對照組。前者可能是受體飽和效應現(xiàn)象,而后者是受體下調(diào)和(或)減敏現(xiàn)象抑或培養(yǎng)細胞滲透環(huán)境的改變所致,具體機制有待進一步的明確。有研究[7]表明某些多糖對免疫系統(tǒng)呈雙向調(diào)節(jié)作用,提示把握ABPS抑癌作用的最適劑量特別重要。

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