王 濤,侯桂琴

1)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液腫瘤科鄭州 450000 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州 450001

△男,1979年4月生,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:腫瘤免疫,E-mail:zangwenqiao@sina.com

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤特異性凋亡抑制因子,是凋亡抑制蛋白家族(inhibitors of apoptosis proteins,IAPs)中作用最強(qiáng)的分子,在多種腫瘤組織中皆表達(dá)增高。Survivin主要是通過和Caspase蛋白結(jié)合抑制其級聯(lián)激活反應(yīng)而發(fā)揮抗凋亡作用[1-2]。在Caspase家族中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的一個主要效應(yīng)分子,參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。若Caspase-3表達(dá)異常則可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和增殖失調(diào),從而參與腫瘤等多種疾病的發(fā)生。作者采用免疫組織化學(xué)方法檢測人食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況,探討其臨床意義,分析 2者的關(guān)聯(lián)性,為食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科 2006年至 2008年診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌的手術(shù)存檔標(biāo)本 60例及取自其他手術(shù)患者的正常食管黏膜組織存檔標(biāo)本 60例。食管鱗狀細(xì)胞癌患者中男33例,女 27例;中位年齡43.2歲;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 31例;浸潤至淺層(黏膜和淺肌層)36例,浸潤至深層(深肌層和外膜)24例。

1.2 正常食管黏膜和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中 Survivin和Caspase-3蛋白檢測方法 抗Survivin和抗Caspase-3兔抗人多克隆抗體、SP免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?？筍urvivin和抗Caspase-3兔抗人多克隆抗體的工作濃度均為 1:100。免疫組織化學(xué)染色按照SP試劑盒的操作步驟進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照,已知陽性表達(dá)的宮頸癌組織切片作為陽性對照。Survivin和Caspase-3陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒,均位于癌細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi),間質(zhì)平滑肌細(xì)胞也有部分著色。在高倍視野下選取 5個視野(每個視野觀察不少于200個細(xì)胞),按陽性細(xì)胞所占的百分比及著色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定。①按著色強(qiáng)度評分:無著色為0分;淺黃色為1分;黃色為2分;棕黃色為3分。②按陽性細(xì)胞百分比評分:無陽性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為 1分,10%～為 2分,50%～為 3分, 75%～為 4分。取 2項(xiàng)評分的乘積作為總積分,0～3分為陰性,＞3分為陽性[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用 χ2檢驗(yàn)比較食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管黏膜組織中Survivin和Caspase-3蛋白陽性表達(dá)率的差異;采用 χ2檢驗(yàn)比較食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白陽性表達(dá)率與臨床病理特征的關(guān)系;計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù)分析食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin與Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 正常食管黏膜和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況 結(jié)果見圖1、表1。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌(A)和正常食管黏膜(B)組織中Survivin及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況(SP,×400)1:Survivin蛋白;2:Caspase-3蛋白。

表1 正常食管黏膜和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況例(%)

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果見表2。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系例(%)

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin與Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 結(jié)果見表3。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin與Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

3 討論

凋亡也稱程序性細(xì)胞死亡,是機(jī)體細(xì)胞自主性死亡的過程。凋亡對生物的生長、發(fā)育、免疫記憶、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等都起著極為重要的作用。凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜,但主要可以歸結(jié)為凋亡促進(jìn)因子和凋亡抑制因子的調(diào)節(jié),當(dāng) 2者表達(dá)適宜并呈現(xiàn)一定的比例,細(xì)胞的凋亡與增殖才能處于動態(tài)平衡,機(jī)體才能有效行使正常的生理功能。而當(dāng) 2者表達(dá)異常,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的平衡失控就可能引起腫瘤的發(fā)生[4]。

Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的抗細(xì)胞凋亡因子,是IAPs家族的新成員[5]。Survivin定位于人類染色體17q25,全長14 700 bp,有4個外顯子和 3個內(nèi)含子,可編碼3種不同的蛋白:Survivin-140、Sur-vivin-121和Survivin-40。survivin基因編碼的蛋白質(zhì)含有 142個氨基酸,相對分子質(zhì)量為 16 200,僅含有單一的桿狀病毒IAP重復(fù)序列功能區(qū),為Survivin發(fā)揮抗凋亡作用所必需,在調(diào)控細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡中起重要作用。Survivin通過直接與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合而抑制多聚ADP核糖聚合酶裂解來阻斷凋亡過程[6]。另外,Survivin也可通過抑制P21間接抑制Caspase-3的活化,從而抑制細(xì)胞凋亡[7]。

Caspase是一組具有相似的氨基酸順序、二級結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶。Caspase家族成員在細(xì)胞凋亡的啟動和完成過程中起重要作用,是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者,決定了凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變和生物化學(xué)改變[8]。在目前已發(fā)現(xiàn)的 Caspase家族成員中, Caspase-3與凋亡的關(guān)系密切,參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]?；罨腃aspase-3蛋白能使許多與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)相關(guān)的蛋白和激酶失活,從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生,是關(guān)鍵的效應(yīng)分子[10]。

該研究結(jié)果顯示,在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中隨癌細(xì)胞浸潤深度的加深,Survivin蛋白陽性表達(dá)率增高,且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中Survivin蛋白的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織。同時在食管鱗狀細(xì)胞癌及正常食管黏膜組織中,Caspase-3蛋白陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且Caspase 3蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示,在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)有關(guān)聯(lián)。推測在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和演進(jìn)過程中,Survivin蛋白的高表達(dá)通過抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增生;而Caspase-3蛋白隨癌細(xì)胞分化程度的降低表達(dá)增高,表明其活性隨腫瘤惡性程度的增加而受到抑制,提示Survivin可能通過抑制Caspase-3的活性而起到抑制癌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述,凋亡抑制基因survivin與促凋亡基因caspase-3在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,Survivin蛋白調(diào)控Caspase-3蛋白表達(dá)可能是食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán),為探討食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。survivin基因有望成為食管鱗狀細(xì)胞癌基因治療過程中的靶點(diǎn),為食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷治療提供一條新的途徑。

[1]Lopes RB,Gangeswaran R,McNeish IA,et al.Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is important for resistance to chemotherapy[J].Int JCancer,2007,120(11):2 344

[2]Wagener N,Crnkovic-Mertens I,Vetter C,et al.Expression of inhibitor of apop tosis protein Livin in renal cell carcinoma and non-tumorous adultkidney[J].Br JCancer,2007, 97(9):1 271

[3]龐霞,鄭湘予,李晟磊,等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織中血管內(nèi)皮生長因子-C與血小板生長因子-4蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2008,43(5):865

[4]Schmollinger JC,Dranoff G.Targeting melanoma inhibitor of apoptosis protein with cancer immunotherapy[J].Apoptosis,2004,9(3):309

[5]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel antiapoptosis gene,survivin,exp ressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med,1997,3(8):917

[6]Shin S,Sung BJ,Cho YS,etal.An antiapoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and 7[J]. Biochemistry,2001,40(4):1 117

[7]Suzuki A,Ito T,Kawano H,et al.Survivin initiates procapase3/p21 complex formation as a resultof interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene, 2000,19(10):1 346

[8]Robertson GS,Croker SJ,Nicholson DW,et al.Neuroprotection by the inhibition of apoptosis[J].Brain Pathol, 2000,10(2):283

[9]Grutter MG.Caspase:key p layers in programmed cell death [J].Curr Opin Struct Biol,2000,10(6):649

[10]易鐵男,周云峰,伍鋼.Caspase家族與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊,2001,28(1):39