趙 維，李建科*

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

高脫乙酰度蛹渣殼聚糖制備工藝優(yōu)化

趙 維，李建科*

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

制備高脫乙酰度蛹渣殼聚糖。在蛹渣殼聚糖制備工藝單因素試驗研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法研究無水乙醇浸泡時間、氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度、處理時間及料液比對殼聚糖脫乙酰度的影響，建立脫乙酰度對5個試驗因素的正交回歸模型，通過頻率分析法確定蛹渣殼聚糖較優(yōu)的制備條件范圍并得到蛹渣殼聚糖的最佳制備工藝。最佳工藝為：無水乙醇浸泡1.7h、氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)44%、處理溫度94℃、處理時間9h、料液比1:28(g/mL)、每2h換堿1次。在此工藝條件下，殼聚糖的脫乙酰度95.96%、相對分子質(zhì)量7.45×105、產(chǎn)率56.98%、水分含量3.20%、灰分含量0.35%，產(chǎn)品為原白色，外觀色澤好，主要指標(biāo)均達(dá)到相關(guān)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

蛹渣；殼聚糖；高脫乙酰度；制備工藝

甲殼素是天然存在的唯一堿性多糖[1]，在自然界中的存儲量僅次于纖維素。對甲殼素進(jìn)行脫乙酰化反應(yīng)便可得到殼聚糖。殼聚糖由于存在游離氨基，因而具有許多纖維素沒有的獨特性質(zhì)。殼聚糖是一種具有巨大潛能的生物大分子，它具有多種生物活性，擁有出色的生物相容性和可完全分解性[2]。殼聚糖良好的吸附性、成膜性、通透性、成纖性、吸濕性、抑菌性和保濕性使其在食品、醫(yī)藥、化工、環(huán)境等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[3]。

目前市售的殼聚糖基本來源于蝦蟹殼[4]，其生產(chǎn)工藝也已成熟。但以蠶蛹提取油和蛋白質(zhì)后的蛹渣為原料提取甲殼素，進(jìn)而脫乙酰制備殼聚糖的工藝流程及產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)差異較大[5-9]，而且缺乏對高脫乙酰度蛹渣殼聚糖制備工藝的研究。中國是一個蠶業(yè)大國，蠶蛹產(chǎn)量相當(dāng)可觀[10]，因此有必要對高脫乙酰度蛹渣殼聚糖的制備工藝進(jìn)行深入探討。本實驗選取二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法建立數(shù)學(xué)模型，采用無水乙醇浸泡輔助脫乙?；c間歇式堿處理相結(jié)合的方法制備高脫乙酰度蛹渣殼聚糖，同時測試其脫乙酰度、表觀黏度和分子量等理化指標(biāo)，以期為蛹渣的利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹渣甲殼素：從提取油和蛋白的蛹渣中自制而得，為淡黃色粉末。

無水乙醇、氫氧化鈉、冰乙酸、無水碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、甲基橙均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HSY2-SP恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SC69-02C水分快速測定儀 上海第二天平儀器廠；SPJX-4-13箱式電阻爐 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；烏氏黏度計(0.5～0.6mm常數(shù)毛細(xì)管黏度計) 上海申誼玻璃制品有限公司；RVDV-II+Pro黏度計 美國博利飛公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹渣甲殼素的預(yù)處理

在反應(yīng)前，采用蒸餾水浸泡甲殼素30min，避免殼聚糖產(chǎn)品顏色太深。

1.3.2 蛹渣殼聚糖制備

本實驗采用無水乙醇浸泡輔助脫乙?；c間歇式堿處理相結(jié)合的方法制備蛹渣殼聚糖。稱取1.00g蛹渣甲殼素粉末原料于150mL錐形瓶中，加入15mL無水乙醇浸泡一定時間，再加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH溶液，攪拌均勻后，浸泡10min，放入一定溫度的水浴鍋中反應(yīng)，每隔2h取出過濾水洗至中性，取濾渣換堿1次，反應(yīng)完全后取渣在60℃下干燥至質(zhì)量恒定。

1.3.3 蛹渣殼聚糖制備的單因素試驗

分別考察無水乙醇浸泡時間、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度、處理時間和料液比對蛹渣殼聚糖脫乙酰度的影響。

1.3.4 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合因素水平設(shè)計原則確定因素水平的范圍，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)法5(1/2)組合進(jìn)行設(shè)計，共進(jìn)行36次試驗。試驗結(jié)果采用DPS v3.01數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.5 蛹渣殼聚糖指標(biāo)成分的測定

水分含量：用水分快速測定儀測定；灰分含量：采用干法灰化法，具體方法參考文獻(xiàn)[11]；脫乙酰度的測定：采用酸堿滴定法，具體方法參考文獻(xiàn)[12]；表觀黏度的測定：將0.4g殼聚糖樣品溶于40mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液中，在25℃條件下進(jìn)行測定，具體方法參考文獻(xiàn)[13]；相對分子質(zhì)量的測定：測定殼聚糖特性黏度，根據(jù)Mark-houwink方程[η]=KMα計算相對分子質(zhì)量，式中：K=1.64×10-30×(D.D.×100)14；α＝－1.02× 10-2×(D.D.×100)＋1.82；[η]為特性黏度/(mL/g)；M為相對分子質(zhì)量；D.D.為殼聚糖的脫乙酰度/%，具體方法參考文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹渣殼聚糖制備的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 無水乙醇浸泡時間對殼聚糖脫乙酰度的影響

由圖1可知，隨著浸泡時間的延長，殼聚糖的脫乙酰度也隨之增加，這是因為乙醇破壞了甲殼素分子內(nèi)部的氫鍵。當(dāng)浸泡時間超過2h時，脫乙酰度反而會下降，這可能是由于浸泡時間過長，乙醇揮發(fā)，部分被打破的氫鍵又重新締合，不利于NaOH溶液的進(jìn)入，導(dǎo)致脫乙酰度下降[15]。由于1.5h和2h時殼聚糖脫乙酰度差別很小，所以選取1.5h為無水乙醇適宜的浸泡時間。

圖1 無水乙醇浸泡時間對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.1 Effect of soaking time in absolute alcohol on deacetylation degree of chitosan

2.1.2 NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對殼聚糖脫乙酰度的影響

圖2 NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on deacetylation degree of chitosan

由圖2可知，隨著NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，殼聚糖的脫乙酰度也逐漸提高。當(dāng)溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時，再增加溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，脫乙酰度的變化幅度很小，所以選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的NaOH溶液為宜。

2.1.3 處理溫度對殼聚糖脫乙酰度影響

圖3 處理溫度對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.3 Effect of thermal treatment temperature on deacetylation degree of chitosan

由圖3可知，殼聚糖的脫乙酰度隨著處理溫度的升高而增大，當(dāng)溫度為90℃，脫乙酰度為89.99%，當(dāng)溫度為95℃時，脫乙酰度為90.51%，增幅較小，從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，處理溫度選取90℃為宜。

2.1.4 處理時間對殼聚糖脫乙酰度影響

圖4 處理時間對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.4 Effect of thermal treatment time on deacetylation degree of chitosan

由圖4可知，增加處理時間有利于提高殼聚糖的脫乙酰度，當(dāng)處理時間達(dá)到8h時，殼聚糖的脫乙酰度達(dá)到90.82%，再增加處理時間，脫乙酰度的變化不是很大，所以選取8h為最佳處理時間。

2.1.5 料液比對殼聚糖脫乙酰度影響

圖5 料液比對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratio on deacetylation degree of chitosan

由圖5可知，當(dāng)料液比達(dá)到1:25(g/mL)時，殼聚糖的脫乙酰度達(dá)到最大。當(dāng)料液比為1:30(g/mL)時，脫乙酰度會有所下降，這可能是因為過大的料液比會導(dǎo)致部分甲殼素漂浮于溶液表面，附著于容器壁而影響脫乙酰效果。所以選取1:25(g/mL)為適宜的料液比。

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取無水乙醇浸泡時間、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度、處理時間和料液比5個因素進(jìn)行二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計，試驗因素、水平及編碼見表1。

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的因素水平表Table1 Factors and levels in the quadratic orthogonal rotation combination design

2.2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果

根據(jù)表2的試驗結(jié)果，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到蛹渣殼聚糖脫乙酰度與五因子的數(shù)學(xué)回歸模型：

2.2.3 二次回歸模型的顯著性檢驗及模型的重建

X1、X2、X3、X4、X5分別為無水乙醇浸泡時間、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度、處理時間和料液比的編碼值。對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)。由結(jié)果可知：該回歸方程的失擬性檢驗F1=2.773＜F0.05(6,9)=3.37，即：P=0.05102＞0.05不顯著，可認(rèn)為所選的模型適當(dāng)；回歸顯著性檢驗F2=8.327＞F0.01(20,15)=3.36，即：P=0.00001＜0.01極顯著，說明模型預(yù)測值與實際值吻合，可用于蛹渣殼聚糖制備試驗的理論值預(yù)測，模型成立。對回歸系數(shù)顯著性檢驗，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項后，得到優(yōu)化后的回歸方程為：

Y=90.54493＋3.88208X2＋1.71958X3＋2.74042X4－1.62365X22－0.93990X32－1.30365X42＋2.38438X1X4－1.88187X2X4＋2.57313X3X5

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Quadratic orthogonal rotation combination design arrangement and experimental results

蛹渣殼聚糖脫乙酰度與無水乙醇浸泡時間、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度、處理時間和料液比的相關(guān)系數(shù)R2= 91.74，表明該模型5個因素對脫乙酰度的影響占91.74%，而其他因素和誤差占8.26%。

2.2.4 各因素的重要性分析

由表3可知：MSX1=16.8840、MSX2=361.6937、所以，影響蛹渣殼聚糖的5因素主次順序是：NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞處理時間＞處理溫度＞無水乙醇浸泡時間＞料液比。

表3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗方差分析表Table3 Analysis of variance for the developed regression model

2.2.5 單因素效應(yīng)分析

圖6 單因素效應(yīng)分析圖Fig.6 Single factor analysis on the effects of five process conditions on deacetylation degree of chitosan

將其他因素固定在零水平條件下，分別研究無水乙醇浸泡時間(X1)、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、處理溫度(X3)、處理時間(X4)和料液比(X5)對蛹渣殼聚糖脫乙酰度的影響。由圖6各曲線的變化趨勢可知，NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度和處理時間與脫乙酰度的關(guān)系呈開口向下的拋物線形狀，這3個因素對脫乙酰度的影響呈先增大后減小的趨勢。這說明3個因素均存在一個合理的范圍，超過該范圍脫乙酰度就會降低。其中，這3個因素曲線的變化趨勢為NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞處理時間＞處理溫度，說明這3個因素對脫乙酰度的影響逐漸減小。無水乙醇浸泡時間與料液比曲線的變化趨勢很小，說明這兩個因素對脫乙酰度的影響很小。

2.2.6 試驗因素交互效應(yīng)分析

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗可以看出，無水乙醇浸泡時間(X1)與處理時間(X4)、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)與處理時間(X4)、處理溫度(X3)與料液比(X5)的交互作用對蛹渣殼聚糖脫乙酰度的影響明顯，對其分別作圖，可直觀分析各因素的交互作用。

圖7 無水乙醇浸泡時間與處理時間效應(yīng)分析圖Fig.7 Interactive effects of soaking time in absolute alcohol and thermal treatment time on deacetylation degree of chitosan

圖8 NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與處理時間效應(yīng)分析圖Fig.8 Interactive effects of NaOH concentration and thermal treatment time on deacetylation degree of chitosan

圖9 處理溫度與料液比效應(yīng)分析圖Fig.9 Interactive effects of material/liquid ratio and thermal treatment temperature on deacetylation degree of chitosan

從圖7可以看出，處理時間對殼聚糖脫乙酰度作用明顯。將無水乙醇浸泡時間固定在零水平，隨著處理時間的延長，殼聚糖脫乙酰度有上升的趨勢，將處理時間固定在零水平，無水乙醇浸泡時間對殼聚糖脫乙酰度的影響變化不大，但略有下降，可能是由于隨著無水乙醇浸泡時間的延長，無水乙醇揮發(fā)，打開的氫鍵又合上，引起脫乙酰度的下降。

從圖8可以看出，殼聚糖脫乙酰度隨NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高明顯增大，將NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定在零水平，處理時間對脫乙酰度的影響作用也較大，二者的交互作用表現(xiàn)為提取率的增加。

從圖9可以看出，當(dāng)料液比固定在零水平時，隨著處理溫度的升高，殼聚糖脫乙酰度增加，在大部分范圍內(nèi)，料液比的升高有利于提高殼聚糖的脫乙酰度。

2.2.7 最佳制備方案模擬分析

通過DPS v3.01數(shù)據(jù)處理軟件，采用頻率分析法尋找最優(yōu)的因素組合，對殼聚糖脫乙酰度大于95.00%的357個方案運(yùn)用數(shù)學(xué)回歸模型分析，其結(jié)果見表4。

表4 大于95.00%的357個方案中各變量取值的頻率分布Table4 Frequency distribution of variable value in 357schemes resulting in a deacetylation degree of chitosan exceeding 95.00%

在95%的置信區(qū)間內(nèi)殼聚糖脫乙酰度大于95.00%的優(yōu)化因素組合為無水乙醇浸泡時間1.58～1.74h、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)43.06%～44.14%、處理溫度92.88～94.24℃、處理時間8.52～9.09h、料液比1:27.02～1:28.58(g/mL)。取優(yōu)化后提取條件的平均值方案即：無水乙醇浸泡時間1.7h、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)44%、處理溫度94℃、處理時間9h、料液比1:28(g/mL)。按照優(yōu)化后的平均值方案對結(jié)果進(jìn)行驗證，檢測到蛹渣甲殼素的脫乙酰度為95.96%，大于理論預(yù)測值95.39%，進(jìn)一步驗證了二次回歸數(shù)學(xué)模型的合理性。

2.3 蛹渣殼聚糖指標(biāo)成分的測定

按照優(yōu)化的最佳制備工藝，即無水乙醇浸泡時間1.7h、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)44%、處理溫度94℃、處理時間9h、料液比1:28(g/mL)制備高脫乙酰度蛹渣殼聚糖，對殼聚糖的各項指標(biāo)成分進(jìn)行測定，蛹渣殼聚糖的指標(biāo)成分與相關(guān)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]見表5。由表5可知，產(chǎn)品各項指標(biāo)均可達(dá)到相關(guān)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，從而說明該制備工藝的可行性。

表5 蛹渣甲殼素的指標(biāo)成分Table5 Comparisons on major quality indexes between the chotisan prepared in this study and commercially available food grade chotisan

3 結(jié) 論

以蛹渣甲殼素為原料，采用無水乙醇浸泡輔助脫乙?；c間歇式堿處理相結(jié)合的方法制備高脫乙酰度蛹渣殼聚糖，以殼聚糖脫乙酰度為指標(biāo)，應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化制備蛹渣殼聚糖的最佳工藝條件。通過頻率分析法得到的最佳工藝為無水乙醇浸泡時間1.7h、NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)44%、處理溫度94℃、處理時間9h、料液比1:28(g/mL)。此方法簡單易操作，在此工藝條件下，殼聚糖的脫乙酰度95.96%、相對分子質(zhì)量7.45×105、產(chǎn)率56.98%、水分含量3.20%、灰分含量0.35%，產(chǎn)品為原白色，外觀色澤好，主要指標(biāo)均達(dá)到相關(guān)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

[1]陳忻, 袁毅樺, 陳健飛. 從烏賊內(nèi)殼提取β-殼聚糖及其結(jié)構(gòu)表征[J].食品科學(xué), 2004, 25(1): 105-107.

[2]PRASHANTH H K V, THARANATHAN R N. Chitin/chitosan: modifications and their unlimited application potential: an overview[J]. Trends in Food Science and Technology, 2007, 18(3): 117-132.

[3]PAULINO A T, SIMIONATO I J, GARCIA J C, et al. Charaterization of chitosan and chitin produced from silkworm crysalides[J]. Carbohydrate Polymers, 2006, 64(1): 98-103.

[4]王敦, 胡景江, 劉銘湯. 從臭蜣螂中提取甲殼素/殼聚糖的研究[J].林業(yè)科學(xué), 2004, 40(5): 180-185.

[5]張?zhí)m杰, 侯冬巖, 辛廣, 等. 柞蠶蛹外殼殼聚糖的制備及理化性質(zhì)研究[J]. 特產(chǎn)研究, 2005(2): 14-16.

[6]倪紅, 陳懷新, 楊艷燕, 等. 桑蠶蛹甲殼素及殼聚糖的提取與制備工藝研究[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1998, 20(1): 94-96.

[7]曹萍, 朱桂秀. 蠶蛹皮制備甲殼質(zhì)和殼聚糖的研究[J]. 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報, 2007, 7(4): 233-236.

[8]邰寧文, 吉鑫松, 袁中一, 等. 蛹皮殼聚糖的制備及其用作酶固定化載體的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 1997, 9(2): 48-52.

[9]賈廷華, 劉穎, 張燕玲, 等. 柞蠶蛹皮殼聚糖的制備工藝研究[J]. 遼寧絲綢, 2003(1): 10-13.

[10]朱洪紅, 吳大洋. 蠶蛹甲殼素及其功能性產(chǎn)品開發(fā)前景[J]. 中國蠶業(yè), 2007, 28(4): 4-7.

[11]蔣挺大. 甲殼素[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2006: 87-111; 289.

[12]詹永樂, 黃春芳, 陳復(fù)生. 家蠶蛹皮制取殼聚糖的最佳工藝條件[J].化學(xué)通報, 2001(7): 450-453.

[13]朱洪紅. 蠶蛹甲殼素抗菌新材料的研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2008.

[14]陳冬梅. 殼聚糖的降解及其抑菌性、抗氧化性研究[D]. 重慶: 重慶工商大學(xué), 2009.

[15]曹健, 代養(yǎng)勇, 王紅軍, 等. 甲殼素微波法脫乙酰制備殼聚糖的研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(11): 120-125.

Optimization of the Preparation Process for Silkworm Chrysalis-derived Highly Deacetylated Chitosan

ZHAO Wei，LI Jian-ke*
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The chitin obtained as light yellow powder from the residue of silkworm chrysalis left after oil and protein extraction was utilized as the start material to prepare highly deacetylated chitosan in the present study. On the basis of single-factor investigations, quadratic orthogonal rotation combination design was employed to investigate the effects of soaking time in absolute ethanol, NaOH concentration, thermal treatment temperature and duration and material/liquid ratio on deacetylation degree of chitosan. An orthogonal regression model for deacetylation degree of chitosan against the above five factors was constructed. Using frequency analysis method, the optimal conditions for the preparation of highly deacetylated chitosan were determined as follows: soaking time in absolute ethanol, 1.7 h; NaOH concentration, 44%; thermal treatment temperature, 94 ℃; treatment time, 9 h; material/liquid ratio (g/mL), 1:28; and replacement frequency of NaOH, once every two hours. Under these conditions, a product with 95.96% deacetylation degree, 7.45×105relative molecular mass, 56.98% yield, 3.20% moisture content, 0.35% ash content was obtained as natural white chitosan and each of its major quality indexes met the relevant industrial standards.

silkworm chrysalis residue；chitosan；high deacetylation degree；preparation process

TS209

A

1002-6630(2010)20-0121-06

2010-06-30

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項(2009ZDKG-05)

趙維(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：281799@stu.snnu.edu.cn

*通信作者：李建科(1960—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：jiankel@snnu.edu.cn