徐義剛，崔麗春*，李蘇龍，曹際娟，姜艷春，張子群，劉新亮

(1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116065)

多重PCR-DHPLC檢測(cè)4種主要致腹瀉性大腸埃希氏菌方法的建立與應(yīng)用

徐義剛1，崔麗春2,*，李蘇龍1，曹際娟3，姜艷春1，張子群1，劉新亮1

(1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116065)

腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)是引起腹瀉、危害食品安全和人類健康的4種主要大腸桿菌。本實(shí)驗(yàn)基于ETEC LT基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵襲性質(zhì)?；蛐蛄校O(shè)計(jì)了4對(duì)特異性引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)技術(shù)，通過(guò)體系優(yōu)化，建立了致腹瀉性大腸桿菌多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)4種致病菌的目的。該方法靈敏度高，最低檢測(cè)限為EHEC 6×101拷貝/μL、ETEC 1.3×102拷貝/μL、EPEC 9×101拷貝/μL、EIEC 7×101拷貝/μL。特異性試驗(yàn)表明，對(duì)22種共41株細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，所試6株致腹瀉性大腸桿菌均為陽(yáng)性。實(shí)踐證明，該方法具有良好的實(shí)用性，可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的單一或混合感染的檢測(cè)。

致腹瀉性大腸桿菌； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；變性高效液相色譜；檢測(cè)

微生物污染是影響我國(guó)食品安全最突出的因素之一。大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli) 也稱大腸桿菌，與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致腹瀉性大腸桿菌，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[1-2]。致腹瀉性大腸桿菌按其生物學(xué)特性主要分為四類[3-4]：產(chǎn)腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)，在食品衛(wèi)生與食品安全檢測(cè)方面具有重要的意義。

ETEC主要感染兒童和旅游者，發(fā)展中國(guó)家尤為嚴(yán)重，被污染的水和食物是主要傳染源，主要致病因素是大腸桿菌腸毒素LT或ST[5]，感染的臨床癥狀輕度時(shí)為溫和性腹瀉，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為霍亂樣腹瀉癥狀[6]。EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原菌，具有高度傳染性，嚴(yán)重者可致死，病原菌主要感染腸上皮細(xì)胞形成特征性的組織病理?yè)p傷[7]。EIEC主要引起大齡兒童和成年人腹瀉，曾爆發(fā)流行，臨床癥狀為水樣腹瀉，有時(shí)呈現(xiàn)痢疾癥狀[8]。EHEC主要血清型是O157:H7，引起散發(fā)性或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎，可產(chǎn)生志賀氏毒素樣細(xì)胞毒素[9]。

目前我國(guó)致腹瀉性大腸桿菌的檢測(cè)方法主要采用國(guó)標(biāo)法(GB 4789.6—1994《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)——致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》)，檢測(cè)程序?yàn)闃悠贰鼍蛛x培養(yǎng)→革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應(yīng)試驗(yàn)/腸毒素檢查等，操作復(fù)雜繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要4～7d，且檢測(cè)單一。變性高效液相色譜(DHPLC)是一種新的基因高通量分析技術(shù)，利用核酸分子通過(guò)固定相親和力的差異，用流動(dòng)相洗脫時(shí)，不同大小或者不同序列的核苷酸片段在固定相上移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的，具有全自動(dòng)、高通量檢測(cè)的特點(diǎn)。在國(guó)內(nèi)外的醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)方面逐漸得以應(yīng)用，如SNP分析、雙鏈DNA片段分析、微衛(wèi)星分析、mRNA定量分析、引物純度檢測(cè)等[10-14]。因此，可利用DHPLC區(qū)分不同長(zhǎng)度DNA片段的特點(diǎn)，根據(jù)不同致病菌特有基因序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用DHPLC分析檢測(cè)，達(dá)到快速、高通量檢測(cè)食品中病原微生物的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌ATCC 25922、腸出血性大腸桿菌 O157: H7 ATCC 35150、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ATCC 35401、侵襲性大腸桿菌ATCC 43893、腸致病性大腸桿菌ATCC 11775、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、綿羊李斯特氏菌ATCC 33090、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、空腸彎曲菌ATCC 33560、類志賀鄰單胞菌ATCC 14030、普通變形桿菌ATCC49027、豬霍亂沙門氏菌ATCC 10708、福氏志賀氏菌ATCC 12022、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、霍亂弧菌ATCC 14035、副溶血性弧菌ATCC 27519、溶藻性弧菌ATCC33839、創(chuàng)傷弧菌ATCC 33149和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 9610來(lái)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)；溶血性鏈球菌CMCC32121來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)；分離株由本技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試劑

Taq DNA Polymerase NEB公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 TaKaRa公司；復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW北京蘭伯瑞生物技術(shù)公司；三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純) Transgenomic公司；乙腈(色譜純) Fisher公司。1.2儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀 Eppendorf公司；凝膠成像儀 GE公司；電泳儀 Bio-Rad公司；Wave 4500系統(tǒng)、C18DNASep 色譜柱(4.6 mm×50 mm，3μm) Transgenomic公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank中EHEC O157:H7 O抗原基因、ETEC LT基因、EPEC bfpA基因和EIEC侵襲性質(zhì)?；?，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0 設(shè)計(jì)4對(duì)PCR引物，引物由TaKaRa公司合成。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA提取

將菌株分別接種于5mL復(fù)合培養(yǎng)基BPW中，按照每種細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)過(guò)夜，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，具體操作步驟詳見使用說(shuō)明書。

1.3.3 PCR反應(yīng)條件

單重PCR反應(yīng)體系(25μL)：10×PCR緩沖液2.5μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL、模板DNA 1μL，去離子水補(bǔ)充至25μL。單重PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min；95℃變性15s、60℃退火20s、72℃延伸60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。多重PCR反應(yīng)體系(25μL)：10×PCR緩沖液2.5μL、多重PCR引物(10μmol/L)濃度比ETEC: EHEC:EIEC:EPEC=1:1:1.3:1、dNTPs(10mmol/L)4μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)1μL、模板DNA 各1μL，去離子水補(bǔ)充至25μL。多重PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min；95℃變性20s、60℃退火30s、72℃延伸60s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

表1 PCR引物序列Table1 Primers designed in this study for PCR amplification

1.3.4 DHPLC檢測(cè)條件

PCR產(chǎn)物上樣量5μL；柱溫50℃；流速0.9 mL/min；緩沖液洗脫梯度A：42%～58%，B：58%～42%；洗脫時(shí)間10min(A：50mL TEAA、250μL乙腈，去離子水定容至1000mL；B：50mL TEAA、250mL乙腈，去離子水定容至1000 mL)；洗脫的DNA在260nm進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn)

試劑盒法提取1.1.1節(jié)中細(xì)菌的基因組DNA，利用建立的PCR-DHPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將4種致腹瀉性大腸桿菌的PCR產(chǎn)物克隆作為陽(yáng)性質(zhì)粒，260nm測(cè)定OD值，計(jì)算初始基因拷貝數(shù)，用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋，取各稀釋度樣品5μL，以測(cè)試該方法的檢測(cè)靈敏度。

1.3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將建立的檢測(cè)方法應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐工作中，其結(jié)果與GB 4789.6—1994進(jìn)行比較，驗(yàn)證該方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR-DHPLC檢測(cè)結(jié)果

圖1 致腹瀉性大腸桿菌單重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of single PCR detection of four diarrheogenic E.coli strains

圖2 致腹瀉性大腸桿菌單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DHPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of DHPLC detection of single PCR amplification products of four diarrheogenic E.coli strains

基于4種致腹瀉性大腸桿菌特異性基因序列，設(shè)計(jì)了4對(duì)PCR擴(kuò)增引物，通過(guò)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立單重PCR方法，該方法能夠有效擴(kuò)增出4種致病菌目的基因片段(圖1)。采用DHPLC技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物(圖2)，結(jié)果顯示該技術(shù)能夠?qū)⑵未笮〔煌?種致病菌的PCR產(chǎn)物根據(jù)出峰時(shí)間的不同有效區(qū)分開。

2.2 多重PCR-DHPLC檢測(cè)結(jié)果

在單重PCR基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了4種致腹瀉性大腸桿菌多重PCR方法(圖3)。多重PCR產(chǎn)物經(jīng)變性高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果見圖4，利用變性高效液相色譜技術(shù)能夠一次性檢測(cè)出片段大小不同的4種致病菌的PCR產(chǎn)物，根據(jù)出峰時(shí)間的不同有效的區(qū)分開。

圖3 致腹瀉性大腸桿菌多重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of multiplex PCR detection of four diarrheogenic E.coli strains

圖4 致腹瀉性大腸桿菌多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DHPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of DHPLC detection of multiplex PCR amplification products of four diarrheogenic E.coli strains

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用建立的檢測(cè)方法對(duì)表2中的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，腸出血性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌和產(chǎn)腸毒性大腸桿菌等4種致腹瀉性大腸桿菌均為陽(yáng)性，其他菌株為陰性，說(shuō)明本研究所建立的檢測(cè)方法具有高度特異性。

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

表2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of specificity evaluation

將4種致腹瀉性大腸桿菌的PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒，作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，測(cè)定OD260值，計(jì)算初始基因拷貝數(shù)，然后將其進(jìn)行10倍系列稀釋，取各稀釋度樣品5μL，用建立的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)試其檢測(cè)靈敏度。結(jié)果顯示該方法對(duì)4種致病菌的檢測(cè)靈敏度分別為EHEC 6×101拷貝/μL、ETEC 1.3×102拷貝/μL、EPEC 9×101拷貝/μL和EIEC 7×101拷貝/μL。

2.5 實(shí)踐應(yīng)用

表3 多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法的實(shí)踐應(yīng)用Table3 Applications of the developed PCR/DHPLC method

2009年1～11月期間，利用建立的多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)流通的各種肉類、奶類制品及人工污染食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法(GB 4789.6—1994)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表3所示，共檢出陽(yáng)性樣本42份，與國(guó)標(biāo)法檢出結(jié)果相符合，說(shuō)明所建立檢測(cè)方法切實(shí)可行，同時(shí)也反映出食品受到致腹瀉性大腸桿菌污染的普遍性。

3 結(jié) 論

食品安全是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題， 每年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達(dá)數(shù)億起，死亡的0～15歲兒童約170萬(wàn)人[15]。其中，致腹瀉性大腸桿菌是重要的病原之一，特別是嬰幼兒腹瀉，在我國(guó)及國(guó)外腹瀉患者中致腹瀉性大腸桿菌的檢出率、構(gòu)成比、優(yōu)勢(shì)類型及血清型不同[16-20]，給臨床診斷帶來(lái)不便。本研究針對(duì)4種主要的致腹瀉性大腸桿菌特異性靶基因，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)建立的多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法，可一次性檢出4種致腹瀉性大腸桿菌病原菌單一感染或混合感染，實(shí)現(xiàn)通量檢測(cè)。該多重PCR-DHPLC方法比常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定敏感度高，檢測(cè)快速，通量高，同時(shí)避免了PCR方法產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)EB對(duì)人體和環(huán)境帶來(lái)的潛在危害。該方法可用于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)保障食品安全和人類健康具有現(xiàn)實(shí)意義。

[1]孫貴娟, 林毓寧, 鄧其軍, 等. 南寧致瀉性大腸桿菌病原監(jiān)側(cè)與研究[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2000, 22(4): 684-686.

[2]陳萍, 李澤鴻, 邴偉. 致瀉性大腸桿菌研究進(jìn)展[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2007(4): 11-13.

[3]RODRIGUEZ-ANGELES G. Principal characteristics and diagnosis of the pathogenic groups of Escherichia coli[J]. Salud Publica Mex, 2002, 44(5): 464-475.

[4]NATARO J P, KAPER J B. Diarrheagenic Escherichia coli[J]. Clin Microbiol Rev, 1998, 11(1): 142-201.

[5]LEVINE M M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent [J]. J Infect Dis, 1987, 155(3): 377-389.

[6]QADRI F, SVENNERHOLM A M, FARUQE A S G, et al. Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention[J]. Clin Microbiol Rev, 2005, 18(3): 465-483.

[7]TORRES A G, ZHOU X, KAPER J B. Adherence of diarrheagenic Escherichia coli strains to epithelial cells[J]. Infect Immun, 2005, 73(1): 18-29.

[8]LAN R, ALLES M C, DONOHOE K, et al. Molecular evolutionary relationships of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella spp[J]. Infect Immun, 2004, 72(9): 5080-5088.

[9]ROWE P C, ORRBINE E, OGBOM M, et al. Epidemic Escherichia coli O157:H7 gastroenteritis and hemolytic-uremic syndrome in a Canadian Inuit community: intestinal illness in family members as a risk factor[J]. J Pediatr, 1994, 124: 21-26.

[10]HANNACHI M, AMBLER J E, TAYLOR C F, et al. Examination of single and multiple mutations involved in resistance to quinolones inStaphylococcus aureus by a combination of PCR and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)[J]. J Antimicrob Chemother, 2002, 50(5): 649-655.

[11]EAVES D J, LIEBANA E, WOODWARD M L, et al. Detection of gyrA mutations in quinolone-resistant Salmonella enterica by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40 (11): 4121-4125.

[12]BARLAAN E A, SUGIMORI M, FURUKAWA S, et al. Profiling and monitoring of microbial populations by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Microbiol Methods, 2005, 61(3): 399-412.

[13]HURTLE W, SHOEMAKER D, HENCHAL E, et al. Denaturing HPLC for identifying bacteria[J]. Biotechniques, 2002, 33(2): 386-391.

[14]HURTLE W, BODE E, KAPLAN R S, et al. Use of denaturing highperformance liquid chromatography to identify Bacillus anthracis by analysis of the 16S-23S rRNA interspacer region and gyrA gene[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(10): 4758-4766.

[15]張紅波. 我國(guó)食品安全現(xiàn)狀分析及其對(duì)策[J]. 中國(guó)安全科學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 14(1): 15-17.

[16]趙瑞珍, 李連青, 朱慶義等. 產(chǎn)志賀樣毒素且具侵襲力的大腸桿菌性小兒腹瀉[J]. 中華兒科雜志, 2006, 44(2): 136-137.

[17]張道玲, 邵長(zhǎng)喜. 感染性腹瀉病原菌調(diào)查分析[J]. 中國(guó)自然醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 7(2): 83.

[18]凌蘇, 趙星祥, 華冰等. 感染性腹瀉病原菌及藥敏分析[J]. 中華傳染病雜志, 2005, 23(5): 347-348.

[19]KEBEDE A, POLDEMAN A M. Etiology of acute diarrhea in adults in southwestern nigeria[J]. J Clin Microhiol, 2004, 42(8): 3909-3910.

[20]KESKIMAKI M, MATTILA L, PELTOLA H, et al. Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in finns with or without diarrhea during a round-the-world trip[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(12):4425-4429.

Development and Application of a Multiplex PCR/DHPLC Method for Detecting Four Common Diarrheogenic Escherichia coli Strains

XU Yi-gang1，CUI Li-chun2,*，LI Su-long1，CAO Ji-juan3，JIANG Yan-chun1，ZHANG Zi-qun1，LIU Xin-liang1
(1. Technical Centre, Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China；2. Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；3. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116065, China)

Four pairs of specific primers were designed according to the sequences of the LT gene from enterotoxigenic E.coli (ETEC), the bfpA gene from enteropathogenic E.coli (EPEC), the O antigen gene from enterohemorrhagic E.coli (EHEC) and the invasive plasmid gene from enteroinvasive E.coli (EIEC) for the development of a multiplex polymerase chain reaction/denaturing high performance liquid chromatography (PCR/DHPLC) method for the simultaneous detection of the four common diarrheogenic E.coli strains. The PCR/DHPLC method had high sensitivity and its detection limit was 6×101copies/μL for EHEC, 1.3×102copies/μ L for ETEC, 9×101copies/μ L for EPEC and 7×101copies/μ L for EIEC. The specificity evaluation showed that 6 of 41 stains from 22 species were determined to be positive. This method proves to be applicable and suitable for the detection of infection with one or more of the four E.coli strains.

diarrheogenic E.coli；PCR；DHPLC；detection

R155.1；R378.2.1

A

1002-6630(2010)20-0293-05

2010-02-08

黑龍江省青年基金項(xiàng)目(QC2009C90)；黑龍江省博士后基金項(xiàng)目(LBH-Z09)

徐義剛(1978—)，男，獸醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)椴≡⑸镌\斷與防治。E-mail：yigangxu_china@yahoo.com.cn

*通信作者：崔麗春(1977—)，女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：degree82191656@yahoo.com.cn