王會鋒，馮書惠，賈 斌

(河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(鄭州)，河南 鄭州 450002)

香菇中40種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜法測定

王會鋒，馮書惠，賈 斌

(河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(鄭州)，河南 鄭州 450002)

目的：建立香菇中24種有機氯和擬除蟲菊酯、16種有機磷農(nóng)藥殘留量的氣相色譜測定方法。方法：稱取樣品于聚四氟乙烯離心管中，乙腈高速勻質(zhì)提取，上清液濃縮至近干，過Carbon/NH2SPE凈化柱，正己烷和丙酮定容，用GC-ECD和GC-FPD外標法定量。結(jié)果：研究香菇中40種農(nóng)藥的檢測方法，方法的線性范圍為0.016～0.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，回收率為73%～113%，重復性RSD為3.2%～5.9%，檢出限為0.0005～0.05mg/kg。結(jié)論：此氣相色譜法可以應用于香菇等食用菌的多農(nóng)藥殘留量檢測。

農(nóng)藥殘留分析；香菇；食用菌；毛細管氣相色譜

當前，我國食用菌產(chǎn)業(yè)近年來發(fā)展趨勢良好，成為世界上最大的食用菌生產(chǎn)、出口大國，其產(chǎn)值在種植業(yè)中位居第六位，出口年創(chuàng)匯數(shù)億美元。但由于其栽培與加工技術(shù)相對落后，當使用有農(nóng)藥污染的基質(zhì)載體或病蟲害嚴重時的大量用藥，容易造成農(nóng)藥殘留超標嚴重，出口時遇到世界貿(mào)易非關(guān)稅技術(shù)壁壘(農(nóng)殘限量極低)，極大阻礙出口[1-2]。相比國外食用菌農(nóng)殘指標[3]，我國在《無公害食品 食用菌》中僅規(guī)定了敵敵畏、百菌清、多菌靈、溴氰菊酯4種農(nóng)藥的限量[4]。檢測食用菌中有機磷類農(nóng)藥、擬除蟲菊酯農(nóng)藥和部分有機氯農(nóng)藥用3種前處理方法，耗時長且繁瑣[5]。我國現(xiàn)有的食用菌標準中農(nóng)藥指標和種類太少，不能反映我國食用菌生產(chǎn)實際，亟需發(fā)展快速、可靠、靈敏和實用的多農(nóng)藥殘留分析技術(shù)是控制農(nóng)藥殘留、保證食品安全的關(guān)鍵，以利于國內(nèi)消費和出口。

香菇是一種重要食用菌，含有大量多糖、嘌呤、核酸等，檢測時前處理難度高。香菇溶劑提取后比較難過濾，更需要較高的凈化手段。當使用Florisil柱和中性氧化鋁柱，無法除盡色素且對多種農(nóng)藥有吸附；若僅使用ENVI-Carb柱，則無法將色素和極性雜質(zhì)除盡[5-9]。所以凈化后基質(zhì)干擾仍然很大，無法準確上機分析，結(jié)果容易誤判。目前，同時對鮮香菇和干香菇中多種農(nóng)藥殘留的分析尚未見報道[10]。本實驗選取食用菌中的香菇為試樣，研究24種有機氯和擬除蟲菊酯、16種有機磷農(nóng)藥殘留量的氣相色譜法檢測技術(shù)，能夠提高多組分農(nóng)藥分析的速度，節(jié)省實驗成本；通過有效的凈化手段，減少假陽性結(jié)果的錯報。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮香菇和干香菇為河南境內(nèi)抽檢樣品。

24種有機氯和擬除蟲菊酯、16種有機磷農(nóng)藥標樣(1mg/mL，編號及農(nóng)藥名稱見表1)，購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所(天津)，使用時分別用正己烷、丙酮稀釋至適當質(zhì)量濃度配制成混合標準溶液。乙腈、正己烷、丙酮、甲苯均為農(nóng)殘級；氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純。

Agilent 6890N氣相色譜儀(μ-ECD；7890A，F(xiàn)PD)、SampliQ QuEChERS Extract Tubes Agilent公司；DB-608和DB-1701石英毛細管柱 J&W Scientific公司；氮氣、氫氣(純度99.999%) 北京普萊克斯實用氣體有限公司；空氣發(fā)生器 北京匯龍公司；T18 Basic高速組織勻質(zhì)機 IKA公司； EH-20B電加熱板 Lab Tech公司；BRAun CombiMax 600食品加工機 德國博朗公司；3C-3610低速離心機 科大創(chuàng)新中佳分公司；BOND ELUT Carbon/NH2SPE柱(500mg/500mg，6mL) 美國瓦里安公司。

1.2 方法

1.2.1 混合標準溶液的配制

根據(jù)各組分在氣相色譜上的靈敏度，設(shè)1～3組分別吸取編號為1～12、13～24和25～40號的農(nóng)藥標樣(1mg/mL) 0.2～1.0mL于3個25mL容量瓶中，第1、2組為有機氯和擬除蟲菊酯標液用正己烷定容，第3組為有機磷農(nóng)藥標液用丙酮定容，初步配成混標中間液(8～40μg/mL)，再稀釋10倍作為混標添加液(0.8～4.0μg/mL)，把混標液分別用樣品本底溶液和純?nèi)軇?正己烷和丙酮)稀釋5、10、20、40、50倍作混標工作曲線。

1.2.2 氣相色譜條件

有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥：GC-ECD色譜柱DB-608 (30m×320μm，0.5μm)；進樣口溫度250℃；檢測器溫度300℃，程序升溫：初始溫度180℃以10℃/min的速度升至200℃保持2min，然后以5℃/min的速度升至260℃再以20℃/min的速度升至270℃保持20min；高純氮氣柱流量3.0mL/min，尾吹流量60mL/min。

有機磷農(nóng)藥：GC-FPD色譜柱DB-1701(30m×320μm，1.0μm)；進樣口溫度230℃；檢測器溫度250℃，程序升溫：初始溫度80℃以20℃/min的速度升至200℃保持1min，然后以2℃/min的速度升至220℃保持1min后以30℃/min的速度升至250℃保持25min；高純氮氣柱流量3.0mL/min，尾吹流量60mL/min，H2流量75mL/min，空氣流量100mL/min；均采用恒流模式，不分流進樣1μL。

1.2.3 樣品前處理

樣品制備：干、鮮香菇均用四分法取樣，于食品加工機中粉碎成干香菇粉、鮮香菇漿。

方法1：樣品提取：分別稱取干香菇粉2.0g或鮮香菇漿10g(均精確至0.01g)于聚四氟乙烯離心管中，加入乙腈20mL，15000r/min均質(zhì)提取1.5min，加入5～7g NaCl搖勻，4200r/min離心5min，取上清液5mL于50mL燒杯中，通風櫥里65℃電熱板上濃縮至近干，加2mL乙腈-甲苯，待凈化；樣品凈化：于Carbon/NH2SPE柱中加入約2cm高無水硫酸鈉，放在固定架上，下接小燒杯。用10mL乙腈-甲苯(3:1，V/V)預淋小柱，用3×2mL乙腈-甲苯洗滌樣液燒杯，并將洗滌液移入柱中，在柱上加上50mL貯液器，再用25mL乙腈-甲苯洗滌小柱，收集上述所有流出液于小燒杯中，通風櫥里65℃電熱板上濃縮至近干，正己烷定容至2mL，用于GC-ECD和GC-FPD的測定。

方法2：QuEChERS Extract Tubes快速方法實驗。分別稱取干香菇粉2.0g和鮮香菇漿10g(均精確至0.01g)于50mL離心管中，加入無水硫酸鎂、氯化鈉和20mL乙腈，旋緊蓋子劇烈振搖2min，4200r/min離心5min，取上清液5mL于10mL凈化離心管中，再次劇烈振搖2min后離心，收集所有樣液于燒杯中，通風櫥里65℃電熱板上濃縮至近干，正己烷直接定容和過Carbon/NH2SPE凈化后定容至2mL上機測定。

2 結(jié)果與分析

按照1.2.2節(jié)和方法1的分析條件，分別添加混標添加液(0.8～4.0μg/mL) 0.2、0.5、1.0mL至空白干香菇和鮮香菇樣品中，每個水平添加3個樣品，用空白基質(zhì)配的混合標樣定量，即以峰面積(A)和質(zhì)量濃度(c)作校正工作曲線圖外標法計算。應用此方法對在河南抽檢的53個干香菇、鮮香菇樣品進行測定。由表1可見，本方法的回收率為73%～113%，線性范圍為0.016～0.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，農(nóng)藥在香菇中的檢出限(RSN=3)為0.0005～0.05mg/kg。重復性RSD為3.2%～5.9%(表2)，相關(guān)氣相色譜圖比較見圖1～6。

比較圖2和圖4可知，基質(zhì)雜峰干擾程度：鮮香菇＞干香菇，不凈化＞SPE凈化＞快速方法+SPE凈化；比較圖3和圖5、6后得出基質(zhì)干擾程度：有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥測定＞有機磷農(nóng)藥測定，選擇快速方法+SPE凈化成本較高，振搖幅度有個體差別，不如高速均質(zhì)機提取出峰效果好。

表1 干、鮮香菇添加回收率、線性、檢出限、最大殘留限量的測定Table1 Recoveries in dried and fresh mushrooms, regression equation, linear range, correlation coefficient, LOD and MRL

表2 重復性實驗結(jié)果(n=6)Table1 2 Results of repeatability test (n=6)

圖1 正己烷、本底配制有機氯和擬除蟲菊酯標樣(0.08～0.32 μg/mL)色譜圖Fig.1 Chromatograms of n-hexane and shiitake mushroom both fortified with pesticides No. 1 through 12 or with No. 13 through 24

圖2 干香菇及添加SPE凈化、不凈化測定第一組(1～12號)農(nóng)藥色譜圖Fig.2 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.1 through 12 in dried shiitake mushroom

圖3 干香菇及添加QuEChERS+SPE凈化、SPE凈化、不凈化測定第二組(13～24號)農(nóng)藥色譜圖Fig.3 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.13 through 24 in dried shiitake mushroom

圖4 鮮香菇及添加SPE凈化、QuEChERS+SP凈化測定第1、2組(1～24號)農(nóng)藥色譜圖Fig.4 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.1 through 24 in fresh shiitake mushroom

圖5 干香菇及添加SPE、QuEChERS+SPE、QuEChERS、不凈化測定第三組(25～40號)農(nóng)藥色譜圖Fig.5 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.25 through 40 in dried shiitake mushroom

圖6 鮮香菇及添加SPE凈化、QuEChERS測定第三組(25～40號)農(nóng)藥色譜圖Fig.6 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.25 through 40 in fresh shiitake mushroom

3 討 論

3.1 依據(jù)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》提取[11]；按照GB/T 19648—2005《蔬菜和水果中446種農(nóng)藥多殘留測定方法氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》凈化[12]和參考QuEChERS快速方法，建立提取節(jié)約溶劑、凈化準確高效的快速殘留分析方法。離心分層能盡大量收集到有機相，減少試劑揮發(fā)對測定濃度的影響。電熱板濃縮回收率在73%～113%之間。所以選擇均質(zhì)提取+離心分層+電熱板濃縮+SPE凈化的前處理方法，能適用于香菇等食用菌中農(nóng)藥殘留的檢測，結(jié)果能滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

3.2 從圖1、5、6可以看出相同濃度的溶劑配制標樣背景比較干凈，有利于定性，樣品基質(zhì)配制的標樣有一些雜峰的干擾，色譜條件不合適時會影響定性定量。另外基質(zhì)標樣比純?nèi)軇藰映龇逡?，基質(zhì)效應對測定有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥影響大于有機磷農(nóng)藥。所以對有基質(zhì)效應的農(nóng)藥[13]，一般建議用基質(zhì)標樣定量，而不采用溶劑標樣定量。本方法的回收率及測定采用基質(zhì)標樣來校正。

3.3 氣相色譜法中DB-608和DB-1701柱的農(nóng)藥最低檢出限低于或等于國家標準限量(食用菌沒有專門的最大殘留限量參考蔬菜的MRL值)。由于GC-ECD靈敏度十分高，測定有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥時香菇基質(zhì)本底干擾比較大，六六六、滴滴涕、百菌清、腐霉利等小峰檢出比較多，容易造成結(jié)果誤判。所以對GC-ECD的檢測需要強有效的凈化技術(shù)。

3.4 檢出并超標農(nóng)藥需要經(jīng)極性不同色譜柱或GC-MS確證。GC-MS確證可以選擇GC-MS/EI/SIM或GC-MSMS法[14]；確證柱GC-ECD可以選擇DB-1柱[15]，GC/FPD選擇HP-5柱進行雙柱確證。在色譜柱選擇上，GC-ECD靈敏度：DB-1＞DB-608柱，但DB-608柱六六六峰形較尖，且基線分離，其他組分出峰勻稱分布，聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯分離完全，基質(zhì)干擾少，利于準確定量；瑕疵是分析時間比DB-1柱長10min，氯氰菊酯和氟氯氰菊酯分離不如DB-1柱完全，但多個峰加和不影響計算。3.5抽檢的53個香菇中測定百菌清、溴氰菊酯、甲胺磷、甲拌磷、對硫磷、甲基對硫磷、敵敵畏等均未檢出(經(jīng)氣質(zhì)確證)，說明河南香菇質(zhì)量安全比較讓人放心。

4 結(jié) 論

本法可以準確可靠的應用于香菇等食用菌中農(nóng)藥殘留量的檢測。方法的線性范圍為0.016～0.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，回收率為73%～113%，重復性RSD為3.2%～5.9%，檢出限為0.0005～0.05mg/kg，可以應用于香菇等食用菌的多農(nóng)藥殘留量檢測。

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GC Method for the Determination of Forty Pesticide Residues in Shiitake Mushroom

WANG Hui-feng，F(xiàn)ENG Shu-hui，JIA Bin
(Agricultural Quality and Standards and Testing Techniques Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou Center of Inspection and Testing for Agricultural Products, Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China)

Objective: To develop a capillary GC method for the determination of the residues of 24 organochlorines or synthetic pyrethroid and 16 organophosphorus pesticides in shiitake mushroom. Methods: Samples were weighed into Teflon centrifuge tubes and high-speed homogenized with acetonitrile, and the supernatant was then condensed until almost dry and applied to a carbon/NH2 SPE column for cleanup. After recondensation until almost dry, the eluate was rediluted with n-hexane before being injected into the analytical instrument. Electron capture detector was used to detect organochlorines and pyrethroids and flame photometric detector to detect organophosphorus. Using the external standard method, quantitation was carried out. Results: The linear range of the proposed method was between 0.016μg/mL and 0.80 μg/mL, with a correlation coefficient of larger than 0.999, and its recovery, repeatability RSD and detection limit varied from 73.0% to 113%, from 3.2% to 5.9% and from 0.0005 to 0.05 mg/kg. Conclusion: A simple, sensitive and reproducible method applicable to the determination of pesticide multiresidues in shiitake mushroom and other species of mushroom has been developed.

pesticide residue；shiitake mushroom；edible fungi；capillary GC

TS207.53

A

1002-6630(2010)20-0335-07

2010-01-05

王會鋒(1982—)，男，研究實習員，本科，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)研究。E-mail：willup@163.com