許振偉，許 鐘，楊憲時,*，郭全友，李學英

(1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

魚類腐敗菌腐敗能力測定方法

許振偉1,2，許 鐘1，楊憲時1,*，郭全友1，李學英1

(1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

通過分析比較接種腐敗菌的大黃魚無菌魚塊和滅菌魚汁，在貯藏中感官、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVBN)、三甲胺(trimethylamine，TMA)和腐敗菌的變化，以及腐敗菌生長動力學參數(shù)和腐敗代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量因子(YTVBN/CFU和YTMA/CFU)，探討無菌魚塊和滅菌魚汁兩種腐敗能力的測定方法。結(jié)果表明：接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁的貨架期分別為162h和132h，此時的TVBN含量分別為32.16mg/100g和29.64mg/100mL，TMA含量為9.31mg/100g和0.99mg/100mL，腐敗希瓦氏菌菌數(shù)為8.67 lg(CFU/g)和8.56 lg(CFU/mL)，產(chǎn)量因子YTVBN/CFU為2.58×10-10mg TVBN/CFU和1.98×10-10mL TVBN/CFU，產(chǎn)量因子YTMA/CFU 為2.12×10-10mg TMA/CFU和1.27 ×10-11mL TMA/CFU。TMA作為接種魚汁的理化指標是不可靠的，而TVBN可以作為接種魚汁的理化指標。接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁產(chǎn)量因子YTVBN/CFU的相對誤差為23.64%，因此滅菌魚汁作為腐敗菌腐敗能力測定方法具有一定的可靠性。

腐敗菌；腐敗能力；測定方法；無菌魚塊；滅菌魚汁

魚類腐敗是個極其復雜的過程，微生物是導致腐敗變質(zhì)的主要因素。由于魚種、生活水域、捕獲季節(jié)、貯藏條件等的不同，微生物組成復雜多樣，但只有部分微生物參與腐敗過程，即特定腐敗菌 (specific spoilage organism，SSO)[1]，例如磷發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)引起冷藏真空或氣調(diào)包裝水產(chǎn)品腐敗，希瓦氏菌(Shewanella)和(或)假單胞菌(Pseudomonas spp)引起有氧冷藏鮮魚腐敗。特定腐敗菌比其他微生物生長快，并且腐敗能力強。

SSO是造成腐敗的主要因素，而SSO的鑒別必須測定腐敗菌的腐敗能力。通過分析接種腐敗菌的無菌魚塊在貯藏中的腐敗菌生長與代謝產(chǎn)物生成情況，測定腐敗菌腐敗能力的方法已有報道[2]，但無菌魚塊腐敗能力測定方法操作較繁雜。滅菌魚汁的測定方法可以用比濁法測定細菌的數(shù)量，與平板菌落計數(shù)相比，操作簡便，可在短時間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)。本實驗利用比濁法探討腐敗希瓦氏菌菌懸液和光密度間的關系，分析比較無菌魚塊和滅菌魚汁兩種腐敗菌腐敗能力測定方法，為研究魚類特定腐敗菌和開發(fā)魚類保鮮技術提供研究基礎[3]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

活大黃魚購于上海銅川路水產(chǎn)市場，充氧?；钸\送到實驗室。立即敲擊頭部致死，去鱗、去鰭、去內(nèi)臟、清洗，用于制備無菌魚塊和滅菌魚汁。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基 上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司；假單胞菌專用培養(yǎng)基 英國OXOID公司；鹽酸標準溶液 上海市計量測試技術研究院；L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸 上海國藥試劑公司；磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氧化三甲胺、三氯乙酸、苦味酸、鹽酸三甲胺、氧化鎂、硼酸、硫代硫酸鈉等試劑均為分析純。

721型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；0.5Mcfarland Standard麥氏標準管 英國TREK Diagnostic Systems有限公司；Sanyo MIR 153高精度低溫培養(yǎng)箱 日本三洋電器集團；半微量定氮儀 國藥集團化學試劑有限公司；SEX-TJ凈化工作臺 上海整新電子設備；L550低速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腐敗希瓦氏菌菌懸液的制備

挑取實驗室保存的有氧冷藏養(yǎng)殖大黃魚貨架期終點分離、純化、鑒定的腐敗希瓦氏菌(S h e w a n e l l a putrefaciens)純菌株[4]，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基劃線，25℃有氧培養(yǎng)。24h內(nèi)，挑取單菌落于5mL去離子水中，使其濃度達到0.5Mcfarland麥氏標準管中間綠燈處，約108CFU/mL。取300μL上述菌液于300mL滅菌營養(yǎng)肉湯中，25℃培養(yǎng)。菌液濃度達到108CFU/mL后，用滅菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，用于無菌魚塊和滅菌魚汁的接種。

1.2.2 無菌魚塊的制備

依據(jù)Herbert[5]的方法，并參照文獻[2]的方法，無菌操作制備無菌魚塊。

1.2.3 滅菌魚汁的制備

參照Dalgaard[6]的方法制備滅菌魚汁。大黃魚去鱗、去內(nèi)臟、清洗，將魚片剪成細條，組織搗碎機打漿，煮沸、過濾，棄去魚渣。濾液4200r/min離心30min，取上清液再次過濾，濾液加入0.1mol/L磷酸緩沖液、0.056mol/L KH2PO4和0.044mol/L K2HPO4緩沖液，用NaOH/HCl調(diào)pH值為 6.60。每升魚汁中加入1.6g氧化三甲胺(TMAO)、40mg L-半胱氨酸和40mg L-甲硫氨酸。121℃滅菌15min。

1.2.4 接種與貯藏實驗

無菌魚塊的腐敗希瓦氏菌接種參照文獻[2]中的接種方法。滅菌魚汁的腐敗希瓦氏菌接種，無菌操作取0.1mL腐敗希瓦氏菌菌液(濃度106CFU/mL)加入到200mL滅菌魚汁中。接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁貯藏于(5±0.1)℃，每隔12h分別取出進行感官評價，揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVBN)、三甲胺(trimethylamine，TMA)測定和腐敗希瓦氏菌菌落計數(shù)。

1.3 方法

1.3.1 菌液濃度的定量測定

根據(jù)郎伯-比爾定律[7]，在微生物生長過程中對同一菌液同時測OD值和平板菌落計數(shù)，將平板菌落計數(shù)所得菌液濃度作為細菌標準濃度。每隔12h無菌操作取出接種的魚汁于比色杯中，以未接種腐敗菌的滅菌魚汁為參比，在600nm下測定菌液的OD值。

1.3.2 感官評價

參照文獻[2]中的感官評價方法，其中滅菌魚汁的感官評價只對氣味和味道進行評價，并與未接種的空白滅菌魚汁進行對比。

1.3.3 TVBN測定

參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中半微量定氮法測定。結(jié)果表示為mg/100g魚肉和mg/100mL魚汁。

1.3.4 TMA測定

參照GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的測定》和許龍福等[8]的方法修改，采用苦味酸法測定。結(jié)果表示為mg/100g魚肉和mg/100mL魚汁。

1.3.5 微生物計數(shù)

接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁的微生物計數(shù)參照GB/T 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：菌落總數(shù)測定》進行測定。腐敗希瓦氏菌菌落計數(shù)選擇鐵瓊脂培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，全部黑色菌落計數(shù)。

1.3.6 腐敗菌腐敗能力的定量分析

參照文獻[2]把產(chǎn)生異臭味時單位腐敗菌產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物的量，即產(chǎn)量因子YTVBN/CFU和YTMA/CFU作為腐敗菌腐敗能力的定量指標。

式中：YTVBN/CFU為單位腐敗菌產(chǎn)生TVBN的量/(mg TVBN/CFU)；YTMA/CFU為單位腐敗菌產(chǎn)生TMA的量/(mg TMA/CFU)；N0為初始菌數(shù)；NS為貨架期終點時的腐敗菌數(shù)即最小腐敗菌數(shù)；(TVBN)0、(TVBN)S為初始點和貨架期終點時的TVBN量；(TMA)0、(TMA)S為初始點和貨架期終點時的TMA量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

OD值、感官、TVBN和TMA的變化用Microsoft Excel進行多項式回歸分析，微生物生長采用Zwietering等[9]修正的Gompertz方程描述，用Statistica 6.5進行非線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液濃度和OD值的關系

圖1 滅菌魚汁腐敗希瓦氏菌濃度和OD值的關系Fig.1 Plot of optical density versus bacterial count of Shewanella putrefaciens in sterilized fish juice

滅菌魚汁腐敗希瓦氏菌濃度和OD值的關系見圖1，回歸方程為： y=0.02x－0.0569(y代表OD值，x代表腐敗希瓦氏菌濃度，用lg(CFU/mL)表示)，從圖1中可以看出兩者有較好的相關性(R2=0.975)，滅菌魚汁達到感官拒絕點時OD600nm=0.117，此時腐敗希瓦氏菌濃度為8.56 lg(CFU/mL)。

由表1可見，OD值法測定的相對誤差都小于5%。由滅菌魚汁腐敗希瓦氏菌濃度和OD值的標準曲線方程計算測定值，由平板計數(shù)法得到標準濃度，一般準確度可用相對誤差表示，重復5次，測定值的相對誤差小于5%可認為準確，因此可認為OD值法測定貯藏中魚汁的腐敗希瓦氏菌濃度有較高的準確度。

表1 OD值法測定的準確度Table1 Results of accuracy test for bacterial count determination by optical density method

2.2 貯藏中的感官變化

圖2 接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁在5℃貯藏的感官變化Fig.2 Sensory quality change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5 ± 1) ℃ storage

由圖2可見，魚塊和魚汁分別在84h和72h感官評分達到1(高品質(zhì)期終點)，開始出現(xiàn)輕微異臭味。分別在162h和132h感官評分達到2(感官拒絕點)，魚塊表面黏稠、發(fā)亮，出現(xiàn)強烈的惡臭味，魚汁渾濁，發(fā)綠，出現(xiàn)強烈的腥臭味。

2.3 貯藏中TVBN值的變化

圖3 接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁在5℃貯藏TVBN的變化Fig.3 TVBN change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5±1) ℃ storage

由圖3可見，魚塊和魚汁TVBN初始值分別為8.71mg/100g和6.29mg/100mL。在12～120h內(nèi)，無菌魚塊TVBN值變化不明顯，在13～16mg/100g之間波動，120h后TVBN值隨貯藏時間明顯增加。滅菌魚汁TVBN值在整個貯藏過程中隨貯藏時間明顯增加。達到感官拒絕點時兩者的TVBN值分別為32.16mg/100g和29.64mg/ 100mL。

2.4 貯藏中TMA的變化

圖4 接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁在5℃貯藏TMA的變化Fig.4 TVBN change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5±1) ℃ storage

由圖4可見，魚塊和魚汁TMA初始值都接近于零，隨著貯藏時間的延長TMA值不斷增加，在60h前，二者TMA含量增加較緩慢，60h后接種魚塊的TMA含量快速增加，而接種魚汁的TMA含量增加不明顯。到達腐敗點時二者的TMA值分別為9.31mg/100g和0.99mg/ 100mL。

2.5 貯藏中腐敗菌的變化

圖5 接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁在5℃貯藏腐敗菌數(shù)的變化Fig.5 Bacterial count change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5±1)℃ storage

圖5 是接種腐敗菌的無菌魚塊和滅菌魚汁貯藏中腐敗菌的生長曲線，兩者的回歸相關系數(shù)值均較高(R2分別為0.988和0.976)。用修正Gompertz方程描述接種腐敗菌的無菌魚塊生長動態(tài)是典型的S型曲線，而滅菌魚汁的生長曲線變化較快。接種魚塊和魚汁初始點的菌數(shù)分別為1.9×104CFU/g和3.2×102CFU/mL。魚塊中腐敗菌的延滯期較長，為41h，而魚汁中腐敗菌的延滯期相對較短，僅為2 1 h。

2.6 腐敗菌生長動力學參數(shù)和腐敗能力定量分析

表2 無菌魚塊和滅菌魚汁在5℃貯藏腐敗菌的生長動力學參數(shù)Table2 Growth kinetic parameters of Shewanella putrefaciens in fish block and juice during (5±1) ℃ storage

表2是接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁貯藏中的腐敗菌的生長動力學參數(shù)。兩者的最大比生長速率(μmax)分別為0.0927/h和0.0849/h，相差不大。生長延滯期(Lag)分別為41.1h和21.3h，接種魚塊的延滯時間明顯較接種魚汁的長，這是因為魚塊是固體培養(yǎng)基結(jié)締組織緊密，微生物需要較長的適應時間，而魚汁是液體培養(yǎng)基更有利于微生物的生長。

表3 無菌魚塊和滅菌魚汁在5℃貯藏腐敗菌的腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子Table3 Yield factors of microbial metabolites in fish block and juice during (5±1) ℃ storage

表3是接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊和滅菌魚汁貯藏中腐敗菌的腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVBN/CFU和YTMA/CFU。由表3可見，無菌魚塊的腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子大于滅菌魚汁的產(chǎn)量因子，尤其是YTMA/CFU。貯藏過程中滅菌魚汁的TMA含量明顯低于無菌魚塊，即使在腐敗點時含量也很低，這可能是因為魚汁在經(jīng)過煮沸、過濾、滅菌處理后一些含氮物質(zhì)損失所致。在魚汁制作過程中為防止魚汁中TMAO的稀釋和熱分解，加入了TMAO，但腐敗時TMA含量仍然很低，導致產(chǎn)量因子YTMA/CFU很低，因此滅菌魚汁的腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTMA/CFU不能作為腐敗菌腐敗能力的定量指標。

以接種腐敗希瓦氏菌的無菌魚塊的腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVBN/CFU值為標準，接種腐敗希瓦氏菌的魚塊和魚汁的腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVBN/CFU的相對誤差為23.64%，因此滅菌魚汁作為腐敗菌腐敗能力測定方法具有一定的可靠性。

3 討論與結(jié)論

通常菌懸液濃度的測定采用顯微計數(shù)，此法效率很低且因人為因素使測定結(jié)果有較大誤差。用光電比色計或分光光度計等此類儀器測定菌懸液濃度，簡便、快速而準確。本實驗研究腐敗希瓦氏菌菌懸液和光密度間的關系，在600nm波長處，測定菌液OD值，以OD值表示菌量。羅泰來等[10]對分枝桿菌計數(shù)方法進行比較研究，建立紫外分光光度計法相對于平板計數(shù)法的標準曲線。李華等[11]對酒酒球菌計數(shù)方法進行研究，分別比較了平板計數(shù)法、濁度計法、OD值法，得出酒酒球菌計數(shù)時最好用濁度計法代替平板計數(shù)法。Winter等[12]研究快速估計食品和食品加工設備微生物數(shù)量的方法。在應用比濁法研究菌懸液和光密度間的關系時，濃度測定的絕對誤差依賴于制作標準曲線時顯微計數(shù)的準確程度，不同的細菌應建立相對應的標準曲線。

Dalgaard等[6]用滅菌鱈魚魚汁研究氣調(diào)包裝鱈魚片冷藏中的優(yōu)勢腐敗菌磷發(fā)光桿菌(P h o t o b a c t e r i u m phosphoreum)和腐敗希瓦氏菌的腐敗能力，得出包裝鱈魚腐敗主要是由磷發(fā)光桿菌引起。Gram等[13]研究尼羅河新鮮和腐敗著的鱸魚細菌學時，將細菌接種到殺菌過的鱸魚肉湯中，通過其腐敗氣味，以確定其腐敗能力，用氧化三甲胺培養(yǎng)基來測試產(chǎn)生三甲胺和硫化氫的能力，得出假單胞菌是冰藏鱸魚的特定腐敗菌。Truelstrup等[14]將磷發(fā)光桿菌接種到鮭魚汁和冷熏鮭魚塊，研究了其產(chǎn)生醋酸的能力。Miller等[15]將熒光假單胞菌和腐敗假單胞菌接種到無菌美洲平鲉魚塊中，利用GC-MS研究其產(chǎn)生的腐敗物質(zhì)。Gram等[16]研究熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌在鱸魚魚汁和魚塊中的相互作用，比較其腐敗能力，得出高濃度的假單胞菌對腐敗希瓦氏菌有一定的抑制作用。Joffraud等[17]利用輻照技術得到滅菌的冷熏鮭魚塊，用于腐敗菌腐敗能力的研究。郭全友等[18]對養(yǎng)殖大黃魚冷藏過程菌相進行分析得出腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是其優(yōu)勢腐敗菌。李學英等[2]利用無菌魚塊對大黃魚腐敗菌腐敗能力進行了初步分析，得出腐敗希瓦氏菌具有很強的腐敗潛力(產(chǎn)生強烈異臭味)，但腐敗活性較低，需要較高的濃度才能引起腐敗。

無菌魚塊是天然培養(yǎng)基，其無菌是相對而言的，本身含有一定數(shù)量的微生物，無菌魚塊制備后菌落總數(shù)應小于102CFU/g[5]，在制作過程中嚴禁外源污染，無菌魚塊更接近腐敗菌的生長環(huán)境，可作為腐敗能力研究的基質(zhì)。滅菌魚汁是經(jīng)殺菌過的，用于腐敗菌腐敗能力的測定快速、簡便，可在短時間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)。實驗表明滅菌魚汁作為腐敗菌腐敗能力測定方法具有一定的可靠性。

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Comparative Evaluation of Two Methods for Determining Spoilage Ability of Fish Spoilage Bacterium Shewanella putrefaciens

XU Zhen-wei1,2，XU Zhong1，YANG Xian-shi1,*，GUO Quan-you1，LI Xue-ying1
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

After inoculation with Shewanella putrefaciens, a common fish spoilage bacterium, the sterile block and juice of large yellow croaker were stored at (5 ± 1) ℃, and the changes in sensory quality, total volatile base nitrogen (TVBN), trimethylamine (TMA) and bacterial count, the growth kinetic parameters of this species of bacteria and the yield factors of microbial metabolites (YTVBN/CFUand YTMA/CFU) in sterile fish block and juice during the storage were comparatively measured in order to evaluate the two methods of determining the spoilage ability of Shewanella putrefaciens. The post-inoculation shelf-lives of sterile fish block and juice were 162 h and 132 h, respectively, the TVBNs 32.16 mg/100 mL and 29.64 mg/100 mL, the TMAs 9.31 mg/100 mL and 0.99 mg/100 mL, the bacterial counts 8.67 lg(CFU/mL) and 8.56 lg(CFU/mL), the YTVBN/CFUvalues 2.58×10-10mg TVBN/CFU and 1.98×10-10mL TVBN/CFU, and the YTMA/CFUvalues 2.12×10-10mg TMA/CFU and 1.27×10-11mL TMA/CFU at the end of shelf-life. The reliable parameter indicating the spoilage of fish juice was TVBN rather than TMA. The relative error between the YTVBN/CF values of fish block and juice was 23.64%. Thus, sterile fish juice is a promising matrix for the reliable determination of bacterial spoilage ability.

spoilage bacteria；spoilage ability；determination method；sterile fish blocks；sterilized fish juice

S983

A

1002-6630(2010)20-0355-05

2010-05-31

國家自然科學基金項目(30771675)；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2007GB23260281)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(2007M05)

許振偉(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品微生物安全與質(zhì)量控制。E-mail：xuzhenweixu@163.com

*通信作者：楊憲時(1954—)，男，研究員，本科，研究方向為水產(chǎn)品貯藏加工與品質(zhì)控制。E-mail：xianshiyang@126.com