郭元亨，馬李一，鄭 華，張 弘*，甘 瑾，李 坤

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲(chóng)培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

胭脂紅酸清除自由基的作用

郭元亨，馬李一，鄭 華，張 弘*，甘 瑾，李 坤

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲(chóng)培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

以DPPH自由基、ABTS+·及O2－·3種自由基為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)比較特定波長(zhǎng)下自由基溶液吸光度的變化，評(píng)估胭脂紅酸清除自由基的能力，并與抗壞血酸清除3種自由基的能力做比較。結(jié)果顯示：胭脂紅酸與抗壞血酸對(duì)3種自由基：DPPH自由基、ABTS+·及O2－·均具有清除活性；當(dāng)胭脂紅酸達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)DPPH自由基、ABTS+·及O2－·的清除率分別可達(dá)83%、85%及46.84%左右。結(jié)果表明胭脂紅酸是一種對(duì)自由基具有一定清除活性的食品添加劑。

胭脂紅酸；抗壞血酸；自由基；清除活性

胭脂紅酸(也稱洋紅酸)是雌性胭脂蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的一種天然蒽醌類(lèi)色素。胭脂蟲(chóng)(Dactylopius coccus Costa)是寄生在仙人掌上的一類(lèi)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，原產(chǎn)于拉丁美洲。我國(guó)本無(wú)胭脂蟲(chóng)天然分布，本世紀(jì)初由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所引入我國(guó)，并在我國(guó)西南地區(qū)成功繁育[1-2]。胭脂紅酸約占胭脂蟲(chóng)干蟲(chóng)體質(zhì)量的17%～24%[3]，是(美國(guó))食品及藥物管理局(FDA)允許既可用于食品又可用于醫(yī)藥品和化妝品的染色劑[4]，有研究表明，胭脂紅酸對(duì)因致癌物導(dǎo)致的DNA損傷也有明顯的修復(fù)作用，并可用于病毒性疾病(如水皰性口炎、皰疹性口炎等)、癌癥和艾滋病的防治[5-6]。

自由基具有高度的化學(xué)活性，是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。正常情況下，人體自身自由基代謝處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。若由于各種原因，人體自由基產(chǎn)生過(guò)多或自身的抗氧化體系受到影響，體內(nèi)自由基代謝就會(huì)失去平衡，導(dǎo)致構(gòu)成生物膜的磷脂過(guò)氧化，引發(fā)一系列疾病，如衰老、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等[7-10]。這時(shí)攝入一些自由基清除物，對(duì)維持體內(nèi)自由基平衡，防治疾病，保持機(jī)體健康有積極作用。許多與胭脂紅酸結(jié)構(gòu)相似的蒽醌類(lèi)化合物如大黃酸和蘆薈大黃酸都具有抗氧化活性或清除自由基的功能[11-14]。胭脂蟲(chóng)引入我國(guó)后，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)胭脂紅酸的提取、精制加工及分析檢測(cè)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的報(bào)道[15-20]。但就胭脂紅酸清除自由基的活性，目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以3種不同的自由基為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，評(píng)估胭脂紅酸清除自由基的活性，并與已知具有較強(qiáng)自由基清除活性的抗壞血酸作比較，評(píng)估胭脂紅酸清除自由基的能力，以期為胭脂紅酸的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胭脂紅酸(純度100%) 三榮源株式會(huì)社；抗壞血酸(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基) Sigma公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) (100%) EMD 生物科技有限公司；連苯三酚(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷 上海伯奧生物科技有限公司；過(guò)硫酸鉀(分析純) 天津市化學(xué)試劑三廠；無(wú)水乙醇(分析純) 上?；瘜W(xué)試劑總廠；鹽酸(分析純) 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠；純水實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

DU 800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Beckman Coulter公司；CPC-505斯瑪特專業(yè)pH/電導(dǎo)/離子/溶解氧測(cè)定儀 斯瑪特公司；AB204-S精密型電子天平 Mettler Toledo中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胭脂紅酸與抗壞血酸清除DPPH自由基活性的測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為39.40μg/mL的DPPH自由基乙醇溶液；配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的胭脂紅酸水溶液和抗壞血酸水溶液。按下式計(jì)算胭脂紅酸或抗壞血酸的自由基清除率[21]。

胭脂紅酸對(duì)自由基清除率 /%=(1－ACAi/ACA0)×100抗壞血酸對(duì)自由基清除率/%=(1－AVCi/AVC0)×100式中：ACA0為DPPH自由基乙醇溶液和純水混合液的吸光度與胭脂紅酸溶液和乙醇混合液的吸光度之和；ACAi為DPPH自由基乙醇溶液與胭脂紅酸溶液混合液的吸光度。AVC0為DPPH自由基乙醇溶液與純水混合液的吸光度；AVCi為DPPH自由基乙醇溶液與抗壞血酸溶液混合液的吸光度。以上混合液均為等體積比混合，波長(zhǎng)517nm處測(cè)吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.2 胭脂紅酸與抗壞血酸清除ABTS+·的活性測(cè)定

配制ABTS質(zhì)量濃度為3836μg/mL與過(guò)硫酸鉀質(zhì)量濃度為676μg/mL的混合液，常溫下暗室反應(yīng)16h，將此溶液稀釋50倍待用。配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的胭脂紅酸水溶液和抗壞血酸水溶液。按下式計(jì)算胭脂紅酸和抗壞血酸的ABTS+·清除率[21]：

式中：A0為ABTS+·溶液與等體積純水等體積混合液的吸光度；ACAi和AVCi分別表示ABTS+·溶液加等體積胭脂紅酸水溶液或抗壞血酸溶液，5min內(nèi)每隔0.25min測(cè)得的吸光度；以上檢測(cè)波長(zhǎng)為734nm，每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.3 胭脂紅酸與抗壞血酸清除O2－·的活性測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為126μg/mL的連苯三酚水溶液，并滴加1～2滴0.1mol/L的鹽酸；配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的胭脂紅酸溶液和抗壞血酸溶液；配制pH8.2左右的Tris-HCl緩沖液。按下式計(jì)算胭脂紅酸和抗壞血酸的自由基清除率[22]。

式中：F0=A0i/t；FCAi=ACAi/t；FVCi=AVCi/t；t表示時(shí)間。A0i為T(mén)ris-HCl緩沖液2mL、純水與連苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度；ACAi為T(mén)ris-HCl緩沖液2mL、胭脂紅酸溶液與連苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度；AVCi為T(mén)ris-HCl緩沖液2mL、抗壞血酸水溶液與連苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度。10min內(nèi)每隔0.5min在波長(zhǎng)318nm處測(cè)吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.4 胭脂紅酸與抗壞血酸清除自由基能力的比較

分別以胭脂紅酸與自由基質(zhì)量比mCA/mDPPH自由基、mCA/mABTS和mCA/mPA，以抗壞血酸與自由基質(zhì)量比mVC/mDPPH自由基、mVC/mABTS和mVC/mPA為橫坐標(biāo)，自由基清除率為縱坐標(biāo)，作變化曲線，曲線斜率VCA和VVC表示胭脂紅酸和抗壞血酸清除自由基的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 胭脂紅酸與抗壞血酸清除DPPH自由基活性

圖1 不同質(zhì)量濃度胭脂紅酸清除DPPH自由基的曲線Fig.1 DPPH radical scavenging curves of carminic acid at various concentrations

圖2 不同質(zhì)量濃度抗壞血酸清除DPPH自由基的曲線Fig.2 DPPH radical scavenging curves of ascorbic acid at various concentrations

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的有機(jī)質(zhì)子自由基，易溶于乙醇，溶液呈紫色，在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，若有自由基清除劑存在并與其發(fā)生反應(yīng)，使其褪色，則波長(zhǎng)517nm處的吸光度減小，減小程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。雖然DPPH自由基并非人體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，但對(duì)DPPH自由基的清除能力仍可有效的評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性。

胭脂紅酸和抗壞血酸清除DPPH自由基活性結(jié)果見(jiàn)圖1、2。胭脂紅酸在質(zhì)量濃度在4.50～22.50μg/mL、抗壞血酸質(zhì)量濃度在1.51～7.53μg/mL的范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度遞增而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)胭脂紅酸和抗壞血酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到22.50、7.53μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到83%左右，即清除了溶液中絕大部分的自由基。

按1.3.4節(jié)方法計(jì)算胭脂紅酸和抗壞血酸的清除自由基能力，VCA為132.14，VVC為401.84。胭脂紅酸清除DPPH自由基的能力相當(dāng)于抗壞血酸的33%左右。表明胭脂紅酸對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力。

2.2 胭脂紅酸與抗壞血酸清除ABTS+·活性

圖3 不同質(zhì)量濃度胭脂紅酸清除ABTS+·的曲線Fig.3 ABTS+radical scavenging curves of carminic acid at various concentrations

圖4 不同質(zhì)量濃度抗壞血酸清除ABTS+·的曲線Fig.4 ABTS+radical scavenging curves of ascorbic acid at various concentrations

從圖3、4可以看出，胭脂紅酸和抗壞血酸與ABTS+·的反應(yīng)速度均很快。胭脂紅酸水溶液及抗壞血酸水溶液質(zhì)量濃度分別在3.75～18.75μg/mL和3.02～15.10μg/mL的范圍內(nèi)，對(duì)ABTS+·的清除率隨著質(zhì)量濃度增大而增大。當(dāng)胭脂紅酸水溶液質(zhì)量達(dá)到18.75μg/mL時(shí)；對(duì)ABTS+·的清除率超過(guò)85%，抗壞血酸質(zhì)量濃度達(dá)到15.10μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率超過(guò)97%，即清除了溶液中絕大部分的自由基。

按1.3.4節(jié)的方法比較胭脂紅酸和抗壞血酸清除自由基的能力，VCA為346.77，VVC為529.33。胭脂紅酸清除ABTS+·的能力約為抗壞血酸的66%左右。表明胭脂紅酸對(duì)ABTS+·具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3 胭脂紅酸與抗壞血酸清除O2－·活性

連苯三酚在酸性條件下較穩(wěn)定，有堿性Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)緩沖液存在的條件下，連苯三酚迅速自氧化，自氧化過(guò)程中產(chǎn)生O2－·，O2－·同時(shí)加速連苯三酚自氧化的速率，同時(shí)生成中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物在波長(zhǎng)320nm左右有強(qiáng)吸收，中間產(chǎn)物積累越多，吸收越強(qiáng)[23]。由于自氧化的速率依賴于O2－·的濃度，清除O2－·就能抑制自氧化的速率，阻止中間產(chǎn)物的積累。因此，可以根據(jù)波長(zhǎng)320nm左右吸光度變化速率，推斷中間產(chǎn)物積累速率，進(jìn)一步推斷O2－·被清除的程度，從而評(píng)估目標(biāo)物對(duì)O2－·的清除活性。本研究中，通過(guò)掃描此堿性系統(tǒng)中自氧化產(chǎn)物的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)318nm處有最大吸收，因此選擇318nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖5 不同質(zhì)量濃度胭脂紅酸清除O2－·的曲線Fig.5 Superoxide anion radical scavenging curves of carminic acid at various concentrations

圖6 不同質(zhì)量濃度抗壞血酸清除O2－·的曲線Fig.6 Superoxide anion radical scavenging curves of ascorbic acid at various concentrations

胭脂紅酸及抗壞血酸存在的條件下，連苯三酚在堿性條件下產(chǎn)生自由基速率的情況見(jiàn)圖5、6。按1.3.3節(jié)方法計(jì)算自由基的清除率，見(jiàn)表1。胭脂紅酸水溶液及抗壞血酸水溶液質(zhì)量濃度分別在30.00～150.00μg/mL和17.68～88.40μg/mL的范圍內(nèi)，對(duì)O2－·的清除率隨著質(zhì)量濃度增大而增大。當(dāng)胭脂紅酸水溶液質(zhì)量濃度為30.00

μg/mL時(shí)，對(duì)O2－·幾乎沒(méi)有清除作用，當(dāng)達(dá)到150.00μg/mL時(shí)，對(duì)O2－·的清除率約為46.84%。抗壞血酸質(zhì)量濃度達(dá)到88.40μg/mL時(shí)，對(duì)O2－·的清除率超過(guò)98%，即清除了溶液中絕大部分的自由基。

表1 兩種自由基清除劑質(zhì)量濃度與清除率之間的關(guān)系Table 1 Concentration dependence of superoxide anion radical scavenging ratios of carminic acid and ascorbic acid

根據(jù)1.3.4節(jié)的方法計(jì)算得，VVC為49.58，VCA為156.25，胭脂紅酸清除O2－·的能力約為抗壞血酸的32%左右。表明胭脂紅酸對(duì)O2－·具有清除活性。

3 結(jié) 論

3.1 胭脂紅酸對(duì)DPPH自由基具有一定的清除活性，當(dāng)胭脂紅酸質(zhì)量濃度達(dá)到22.50μg/mL時(shí)，對(duì)溶液中DPPH自由基的清除率可以達(dá)到83%左右。

3.2 胭脂紅酸對(duì)ABTS+·具有較強(qiáng)的清除能力，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到18.75μg/mL時(shí)，胭脂紅酸能夠清除溶液中85%左右ABTS+·。

3.4 胭脂紅酸清除DPPH自由基、ABTS+·和O2－·三種自由基的能力分別相當(dāng)于抗壞血酸的33%、66%和32%。

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Free Radical Scavenging Capacity of Carminic Acid

GUO Yuan-heng，MA Li-yi，ZHENG Hua，ZHANG Hong*，GAN Jin，LI Kun
(Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects, State Forestry Administration, Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

In order to evaluate the ability of carminic acid to scavenge DPPH, ABTS+and superoxide anion radicals, the absorbance changes of the solutions of these three free radicals at certain characteristic wavelengths before and after addition of this acid were measured. Meanwhile, comparison among scavenging activities of carminic acid against these three free radicals was carried out. Carminic acid at certain concentrations could scavenge all of these free radicals and presented scavenging ratios of around 83%, 85% and 46.84% against DPPH, ABTS+and superoxide anion radicals, respectively. This investigation reveals that carminic acid has certain free radical scavenging activity, thereby providing a food additive.

carminic acid；ascorbic acid；free radicals；scavenging activity

TS202.3；S899.3

A

1002-6630(2010)17-0073-04

2010-06-13

科技部成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2007GB24320425)；國(guó)家林業(yè)科技成果推廣項(xiàng)目([2010]11)

郭元亨(1984—)，碩士研究生，主要從事天然資源化學(xué)與利用研究。E-mail：gyh2905030235@sina.com

*通信作者：張弘(1963—)，男，研究員，學(xué)士，主要從事林業(yè)生物資源化學(xué)與利用研究。E-mail：kmzhhong@163.com