周先漢，程麗梅，曾慶梅，張 安，宋俊驊，周典飛

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

超臨界CO2殺菌過程中萃取機(jī)制研究

周先漢1,2，程麗梅2，曾慶梅1，張 安2，宋俊驊2，周典飛2

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

在相同工藝條件下對大腸桿菌菌懸液作超臨界CO2處理，對不同時間段萃取液的成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，萃取物主要有兩大類：非極性脂肪酸類及極性較弱的小分子氨基酸類物質(zhì)，均為細(xì)胞的功能性物質(zhì)。證實在超臨界CO2殺菌過程中確實發(fā)生了萃取作用。

超臨界CO2；萃??；殺菌機(jī)理；大腸桿菌

與熱殺菌、化學(xué)藥物殺菌等傳統(tǒng)殺菌技術(shù)相比，超臨界CO2殺菌很少導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的損失及產(chǎn)生煮熟味，較好解決了殺菌過程中營養(yǎng)成分過多損失及色香味嚴(yán)重劣化等問題；與超高壓等新興的殺菌技術(shù)相比，具有成本低、節(jié)約能源、節(jié)省空間、連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點。

超臨界CO2殺菌技術(shù)由Fraser于1951年發(fā)現(xiàn)[1]，限于當(dāng)時的條件，殺菌效果難以達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用要求。1980年日本學(xué)者Kamihira等[2]用CO2對具有熱敏性特征的生物制品、化合物、食品進(jìn)行了殺菌實驗，效果良好。國內(nèi)直到20世紀(jì)90年代末才見文獻(xiàn)提及并推薦將超臨界CO2流體技術(shù)用于衛(wèi)生、食品殺菌。超臨界CO2使細(xì)胞致死的機(jī)理相對比較復(fù)雜，至今還沒見文獻(xiàn)作出較有說服力的闡述，大多是在相關(guān)推測與實驗相結(jié)合的基礎(chǔ)上提出的一些假設(shè)。目前普遍認(rèn)為，其滅菌機(jī)理主要是以下幾種[3]：1)超臨界CO2處理能抽出微生物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜功能性物質(zhì)，使微生物細(xì)胞受到損傷；2)由于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)CO2電離，使細(xì)胞質(zhì)氫離子濃度增大，pH值下降；3)微生物細(xì)胞內(nèi)某些酶由于浸透在CO2中而失活；4)溶解于微生物細(xì)胞內(nèi)的CO2急速減壓時體積膨脹而使細(xì)胞破裂。本實驗主要研究超臨界CO2處理后萃取液的主要成分，通過對不同時間段萃取液中的脂肪酸和氨基酸標(biāo)志性成分的分析，追溯其來源，探討超臨界CO2殺菌過程中的萃取機(jī)制。由于軟脂酸、硬脂酸等長鏈非極性脂肪酸是構(gòu)成細(xì)菌生物膜的重要組成部分，而生物膜的破壞將導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。丙氨酸、谷氨酸等極性較弱的小分子氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子，氨基酸的缺失將使蛋白質(zhì)合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此確定這兩類物質(zhì)為目標(biāo)物質(zhì)，用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法確定目標(biāo)脂肪酸的種類，用紙色譜法確定目標(biāo)氨基酸的種類。

1 材料與方法

1.1 微生物菌種

大腸桿菌(Escherichia coli 20234)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 材料與試劑

所用培養(yǎng)基及溶液所需試劑均為分析純。

CM0002#液體培養(yǎng)基由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，配方為：蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，pH7.0，121℃下滅菌20min(CM0002#固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～2.0%的瓊脂)。冷卻后放置4℃下，備用。

磷酸鹽緩沖液：Na2HPO40.1mol/L、NaH2PO40.1mol/L，pH7.0；紙色譜展開劑：正丁醇、醋酸、水按體積比4:1:2的比例在分液漏斗中混合，振蕩后放置分層，棄去水層，取上層有機(jī)相，備用；紙色譜顯色劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.25%茚三酮的水飽和正丁醇溶液。

1.3 儀器與設(shè)備

HA121-50-01-C超臨界CO2萃取裝置(萃取釜容積為1L，CO2由合肥恒泰電氣技術(shù)有限公司提供，純度99%)江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；SWO-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-SQ41.28蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SHY-2A恒溫?fù)u床 江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠；YY0027-90電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠； R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司；50μL微量進(jìn)樣器 上海富眾儀器有限公司；QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司；定性層析濾紙。

1.4 菌懸液的制備[4]

取CM0002#液體培養(yǎng)基100mL，無菌環(huán)境中用接種環(huán)刮取一環(huán)培養(yǎng)好的E.coil菌種到CM0002#液體培養(yǎng)基中，30℃搖床中培養(yǎng)16h。培養(yǎng)好的菌液在高速冷凍離心機(jī)中以6000r/min離心10min，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次后倒入400mL無菌磷酸鹽緩沖液中，此時菌懸液的濃度約為108CFU/mL，置于4℃冰箱中貯存。

1.5 活細(xì)胞數(shù)的檢驗

采用平板菌落計數(shù)法。將超臨界CO2處理前后菌液稀釋至一定濃度后，涂布于CM0002#固體培養(yǎng)基平板上，35℃下培養(yǎng)16h后計數(shù)[5]。

1.6 超臨界CO2處理

為排除其他微生物和雜質(zhì)對實驗的干擾，實驗前用75%乙醇對設(shè)備進(jìn)行反復(fù)清洗，然后用無菌蒸餾水進(jìn)行清洗。清洗結(jié)束后在萃取釜和分離釜分別取樣，并涂布平板，計數(shù)，確保設(shè)備無菌。取200mL按1.4節(jié)所述方法制備的菌懸液加入萃取釜中，預(yù)先設(shè)定萃取壓力20MPa，萃取溫度40℃[6-8]。待萃取釜、分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ均達(dá)到設(shè)定的溫度和壓力時開始計時。分別收集30、60、90min萃取液，重復(fù)5次，同一時間段萃取液合并備用。

圖1 高密度CO2滅菌設(shè)備工藝流程圖Fig.1 Schematic diagram for supercritical carbon dioxide sterilization

1.7 萃取液成分分析

超臨界CO2萃取液經(jīng)過正己烷分層萃取后分離得到正己烷層和水層，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到1mL后對兩部分混合物進(jìn)行分析。

1.7.1 正己烷層成分GC-MS分析

正己烷層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后向蒸發(fā)瓶內(nèi)剩余物加入5mL硫酸-甲醇，充分振蕩溶解，55℃恒溫水浴加熱10min后加入5mL正己烷充分萃取，合并萃取液，用飽和NaCl溶液洗滌兩次，靜置去上清液保存?zhèn)溆?。GC分析[9-10]：色譜條件為CPSil88(100m×0.25mm，0.20μm)；程序升溫：初溫70℃，保持10min，以5℃/min升溫至170℃，保持20min，再以2℃/min升溫至190℃，不保持，再以1℃/min升溫至210℃，保持20min；進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度分別為250℃和260℃；載氣為高純氦(He)，流速0.84mL/min；進(jìn)樣量1.0μL，分流比為50:1；質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量70eV，接口溫度260℃，電子倍增器電壓1.89kV，掃描范圍35～500u。

1.7.2 水層成分分析[9,11]

裁取30cm長5cm寬的中速定性層析濾紙，使用微量進(jìn)樣器吸取50μL水層萃取液，在距離濾紙底端約5cm處加樣，一個樣品多次點樣，中間用電吹風(fēng)吹干。在密閉的展開容器中展開，展開劑滲透到離濾紙頂端約5cm處取出，自然干燥，噴顯色劑加熱顯色。計算Rf值。

式中：R為各物質(zhì)斑點中心離開原點的距離；R0為

溶劑滲透前沿離開原點的距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 正己烷層成分GC分析[12]

對超臨界CO2處理30min后的萃取液進(jìn)行GC-MS分析[12-13]，得到氣相色譜圖(圖2)。通過與長鏈脂肪酸和相應(yīng)十九烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的對照，將所得質(zhì)譜圖與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照，確定其脂肪酸的種類有：峰1為軟脂酸甲酯；峰2為硬脂酸甲酯；峰3為油酸甲酯；峰A為加入的內(nèi)標(biāo)物十九烷酸甲酯。

圖2 超臨界CO2處理30min萃取液氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 30 min

對超臨界CO2處理60min后的萃取液進(jìn)行GC-MS分析[14-15]，得到的氣相色譜圖如圖3所示。同法確定其脂肪酸的種類有：峰1為軟脂酸甲酯；峰2為硬脂酸甲酯；峰3為油酸甲酯；峰4為亞油酸甲酯。

圖3 超臨界CO2處理60min萃取液氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 60 min

對超臨界CO2處理90min后的萃取液進(jìn)行GC-MS分析，得到的氣相色譜圖如圖4所示。同法確定其脂肪酸的種類有：峰1為軟脂酸甲酯；峰2為硬脂酸甲酯；峰3為油酸甲酯；峰4為亞油酸甲酯；峰5和峰7為亞麻酸甲酯峰(雙鍵位置不同，出峰時間不同)；峰6為二十二碳六烯酸甲酯(二十二碳六烯酸DHA)；峰8為花生四烯酸甲酯；峰9和峰10為桐油酸甲酯。

通過3個時間段萃取液出峰時間的比對可以發(fā)現(xiàn)：隨著超臨界萃取時間的增加，萃取液中被萃取物質(zhì)的種類不斷增多，而且萃取液中含有硬脂酸、軟脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、桐油酸、花生四烯酸及DHA。這些物質(zhì)主要來自大腸桿菌細(xì)胞上的磷脂類物質(zhì)，在超臨界CO2處理下被萃取出來。

圖4 超臨界CO2處理90min萃取液氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 90 min

圖5 空白對照氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of blank control smaple

空白對照組(不經(jīng)超臨界CO2處理的菌懸液)在以上各時間段均不出峰(圖5)，而通過對不同時間段萃取物的GC-MS分析，可以發(fā)現(xiàn)在超臨界CO2處理過程中大腸桿菌細(xì)胞中的脂肪酸類物質(zhì)被萃取出來，而且對于不同時間段被萃取出物質(zhì)的種類有所差別。

2.2 水層萃取物紙層析

層析濾紙上出現(xiàn)紫色斑點，說明萃取液中可能含有氨基酸、蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)，而雙縮脲反應(yīng)沒有紫色出現(xiàn)，證實溶液中沒有蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)的存在，因此可以斷定溶液中只存在氨基酸類物質(zhì)[16-17]。不同時間段的超臨界萃取液紙層析結(jié)果如表1～3所示。

表1 超臨界CO2處理30min萃取液紙層析Table 1 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 30 min

表2 超臨界CO2處理60min萃取液紙層析Table 2 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 60 min

分析紙層析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個不同時間段萃取液在層析濾紙上都出現(xiàn)了兩個較為明顯的斑點，通過計算得到各點處的Rf。查表氨基酸的Rf值和最小檢知量，發(fā)現(xiàn)其中谷氨酸和甘氨酸的Rf值為0.32，丙氨酸的Rf值為0.39(谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品紙層析結(jié)果得到的Rf值與查表得到的結(jié)果相同)，這3種氨基酸與計算得到的濾紙上氨基酸的Rf值較為接近。因此，濾紙上的氨基酸可能為這3種氨基酸中的兩種或3種。它們必然來自于大腸桿菌細(xì)胞，可能是細(xì)胞中游離的氨基酸，或者是細(xì)胞壁、細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)組分水解而產(chǎn)生的氨基酸。

3 結(jié) 論

通過對超臨界CO2處理后不同時間段大腸桿菌萃取液中脂肪酸類和氨基酸類物質(zhì)成分的分析，可以判定：超臨界CO2殺菌過程中發(fā)生了萃取作用。長鏈脂肪酸類物質(zhì)及一部分極性較弱的小分子氨基酸被萃取出來，并且隨著萃取時間的增加被萃取出的脂肪酸的種類也隨之增加。

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表3 超臨界CO2處理90min萃取液紙層析Table 3 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 90 min

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Extraction Mechanism during the Sterilization of Supercritical Carbon Dioxide

ZHOU Xian-han1,2，CHENG Li-mei2，ZENG Qing-mei1，ZHANG An2，SONG Jun-hua2，ZHOU Dian-fei2
(1.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2.School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Functional components in cytoplasm, cell membrane and cell wall can be dissolved by supercritical carbon dioxide. As a result, the cells will be damaged and die due to inactivation. The extraction mechanism during supercritical carbon dioxide sterilization was explored in this study. An Escherichia coli suspension at a concentration of 108CFU/mL was prepared and treated with supercritical carbon dioxide and composition analysis was performed on the extracts obtained at different time points. The results indicated that both non-polar fatty acids and polar weak small amino acids were the functional components in cells. This investigation demonstrates that extraction indeed occurs during supercritical carbon dioxide sterilization.

supercritical carbon dioxide；extraction；sterilization mechanism；Escherichia coli

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0014-04

2009-11-05

國家自然科學(xué)基金項目(30871739；30571304)；安微省教育廳重點科研項目(KJ2007A099)

周先漢(1959—)，男，副教授，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品深加工、食品安全。E-mail：zhxhan@163.com