陸劍鋒，林 琳，張偉偉，翁世兵，葉應(yīng)旺，姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

水酶法提取斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟油的工藝研究

陸劍鋒，林 琳，張偉偉，翁世兵，葉應(yīng)旺，姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

為提高魚類加工廢棄物的綜合利用率，以斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟為原料，采用水酶法制備魚油。結(jié)果表明：水酶法提取魚油的最佳工藝條件為初始pH7.5、料液比1:1、加酶量3500U/g、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間0.5h，該條件下魚油的提取率達(dá)到80.94%；提取到的魚油(即粗魚油)外觀呈黃褐色，具有魚腥味和輕微的酸敗味，其過氧化值較低，而酸值相對較高；粗魚油中的飽和脂肪酸相對含量為19.42%，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別為61.76%和16.83%，∑n-3/∑n-6的脂肪酸比值達(dá)到3.63。表明斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟是生產(chǎn)魚油的良好來源。

斑點(diǎn)叉尾鮰；內(nèi)臟；魚油；水酶法

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)，又稱溝鲇，屬于鮎形目、鮰科魚類，原產(chǎn)于北美洲，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的大型淡水魚[1]。斑點(diǎn)叉尾鮰具有抗病力強(qiáng)、生長迅速、肉味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，我國于1984年從美國將其引入湖北，近年來被大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，特別是在湖北、湖南、江西、安徽等省，2007年產(chǎn)量達(dá)14萬噸左右，現(xiàn)已被農(nóng)業(yè)部列為重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)對象[2]。

目前，我國斑點(diǎn)叉尾鮰的銷售市場主要是以加工冷凍鮰魚片出口為主，在加工過程中產(chǎn)生了大量的下腳料，包括魚頭、魚排、魚皮和內(nèi)臟等，其中內(nèi)臟平均達(dá)到魚體重的10%左右[3]。相對于海水魚而言，淡水魚的內(nèi)臟體積大，組成復(fù)雜，易腐敗變質(zhì)，但脂肪含量較高，因此可以對其進(jìn)行高值化利用，從中提取可食用魚油，這樣不僅避免了環(huán)境污染，而且對于合理利用資源，提高水產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)的附加值具有重要意義。

生產(chǎn)魚油的方法主要有壓榨法[4]、淡堿水解法[5]、溶劑法[6]、水法[7]、蒸煮法[8]、超臨界流體萃取[9]、水酶法[10]等。相比較而言，水酶法提取油脂的工藝條件較為溫和，不僅有利于增加油脂提取率和提高油脂的品質(zhì)(即有利于提高油脂產(chǎn)量和減輕精煉過程的負(fù)擔(dān))，同時(shí)也能夠有效利用內(nèi)臟中的蛋白質(zhì)資源[11]。本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟為原料，對水酶法提取魚油的工藝路線進(jìn)行研究，旨在為斑點(diǎn)叉尾鮰下腳料的綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點(diǎn)叉尾鮰(一齡魚)內(nèi)臟由明光市永言水產(chǎn)食品有限公司提供，先將內(nèi)臟去除膽囊、鰾及腸道內(nèi)消化物，在組織搗碎機(jī)中搗碎，然后分裝于封口袋中，－24℃冷凍貯藏備用。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RT臺式高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī) 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；YB-1A真空恒溫干燥箱 天津市鑫洲科技有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海大普儀器有限公司；Saturn2200氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 水酶法提取魚油工藝

將一定量經(jīng)過勻漿的斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟解凍后，放入具塞錐形瓶中，加水調(diào)整液料比(g/mL)，用4mol/L的NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)酶解液的初始pH值，然后加入一定量的蛋白酶，并向錐形瓶中填充氮?dú)?抗氧化)，在一定的溫度條件下，保溫水解一段時(shí)間，隨后在5000×g的條件下趁熱離心10min，分離出上層魚油。

1.3.2 原料基本營養(yǎng)成分的測定

水分含量：直接干燥法，參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》；灰分：灼燒稱重法，參照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》；粗蛋白：凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪：索氏抽提法，參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》，并將粗脂肪的含量定為原料中魚油的含量。

1.3.3 蛋白酶活力測定

蛋白酶活力的測定采用紫外分光光度法。酶活力定義：1g固體酶粉或1mL液體酶，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)活力單位，以U/g或U/mL表示[12]。

1.3.4 水解蛋白酶的篩選

由于不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不一致，在提取斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟油中的水解作用也不同，為了得到最佳的提取效果，有必要對蛋白酶進(jìn)行篩選。在參考大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇5種蛋白酶(中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、動物蛋白酶)對斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟分別進(jìn)行酶解，同時(shí)也按照酶制劑產(chǎn)品的使用說明，確定蛋白酶的適宜水解條件見表1。

表1 各種蛋白酶的水解條件Table1 Hydrolysis conditions of various enzymes

1.3.5 魚油的理化性質(zhì)測定

感官評定：參照SC/T 3502－2000《中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：魚油》；水分及揮發(fā)物含量：參照GB/T 5528－2008《動植物油脂水分及揮發(fā)物含量測定》中的直接干燥法；不溶性雜質(zhì)含量：參照GB/T 15688－2008《動植物油脂不溶性雜質(zhì)含量的測定》中的坩堝式過濾器法；酸值：參照GB/T 5530－2005《動植物油脂酸值和酸度測定》中的熱乙醇測定法；碘值：參照GB/T 5532－2008《動植物油脂碘值的測定》中的硫代硫酸鈉滴定法；過氧化值：參照GB/T 5538－1995《油脂過氧化值測定》中的硫代硫酸鈉滴定法。

1.3.6 脂肪酸組成分析

樣品甲酯化[2]：稱取樣品0.5g置于具塞試管中，加入0.5mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液4mL，置于60℃水浴鍋上皂化30min(油珠完全消失)，冷卻后加入12.5%硫酸-甲醇溶液40mL，于60℃水浴上酯化5min，冷卻，將之倒入盛有45mL蒸餾水的分液漏斗中，加入正己烷2mL，放掉下層，用飽和氯化鈉水溶液2mL洗滌至少3次，取上清液再加入2g無水硫酸鈉，取上清液在3000～4000r/min條件下離心10min，用0.22μm微孔過濾膜過濾后，待GC-MS分析。

魚油脂肪酸組成的測定采用氣質(zhì)聯(lián)用儀。GC條件：CP5860石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm)；載氣：高純氦；流速：0.9mL/min；進(jìn)樣口溫度：260℃；柱溫：起始溫度160℃，保持3min，以5℃/min升溫至200℃，再以10℃/min升溫至240℃，保持5min；MS條件：EI離子源，電離能量70eV；離子阱溫度150℃；傳輸線溫度280℃；電子倍增管電壓2400V。通過對NIST(2001版)譜庫檢索，對脂肪酸進(jìn)行定性，并采用面積歸一化法確定其相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟基本組成

由表2可知，斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟中的粗蛋白含量僅占8.58%，而粗脂肪含量達(dá)到28.14%，因此斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟可以作為魚油提取的良好原料，而且魚油提取的廢液

中含有大量的氨基酸和活性多肽，今后也可以進(jìn)一步加工利用。

表2 斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟的基本成分(x±s)Table2 Basic component of the viscera of channel catfish (x±s)

2.2 酪氨酸溶液最大吸收波長的確定

NE向斷裂組：這組斷裂在區(qū)內(nèi)最為發(fā)育，帶內(nèi)主要發(fā)育角礫巖或糜棱巖，該組斷裂被后期斷裂帶切穿，構(gòu)成網(wǎng)格狀，帶內(nèi)具有硅化、碳酸鹽化及弱鉀化，平面上呈舒緩波狀，產(chǎn)狀傾向60°～90°，傾角30°～60°。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜曲線Fig.1 UV absorbency spectrum of tyrosine standard solution

由于酪氨酸帶有芳香環(huán)側(cè)鏈，所以在近紫外區(qū)(200～400nm)內(nèi)對一定波長的光具有選擇性吸收作用。取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在250～375nm的范圍內(nèi)掃描，得到吸收光譜曲線，見圖1。酪氨酸在275nm的紫外光下具有最大吸收峰，因此，選擇在波長275nm處測定不同濃度的酪氨酸溶液的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 蛋白酶的篩選

圖2 不同種類的酶對魚油提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme on the extraction rate of fish oil

蛋白酶水解能力的差異主要是由蛋白酶對肽鍵的專一性不同引起的。將5種蛋白酶的添加量都確定在500U/g、酶解時(shí)間都選擇在3h，按表1條件進(jìn)行酶解，從圖2對魚油提取率的影響可以看出，木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的效果較好，其中風(fēng)味蛋白酶的提油率最高，達(dá)到了86.81%左右，而木瓜蛋白酶的提油率也高達(dá)86.07%。相比之下，木瓜蛋白酶是一種純天然的生物酶制劑，且酶活相對較高、來源豐富、價(jià)格低廉，能充分滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，因此本實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶作為鮰魚內(nèi)臟魚油的提取酶。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 酶解時(shí)間的確定

以酶解時(shí)間為橫坐標(biāo)、魚油提取率為縱坐標(biāo)，繪制酶解時(shí)間與提取率值關(guān)系曲線，如圖3所示。隨酶解時(shí)間的延長(＜1h)，魚油提取率也隨之增加，這主要是酶解時(shí)間的增加，使得酶與底物的作用更加徹底，破壞了脂肪和蛋白質(zhì)的關(guān)系，充分釋放出脂肪。但隨酶解時(shí)間延長(即加熱時(shí)間越長)，魚油多不飽和脂肪酸氧化生成深色物質(zhì)，魚油的顏色出現(xiàn)很大變化，由淡黃色變?yōu)榧t棕色。當(dāng)酶解時(shí)間大于1h后，延長酶解時(shí)間已不能大幅度提升魚油的提取率，因此綜合各方面條件，酶解時(shí)間選擇1 h。

圖3 酶解時(shí)間對魚油提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of fish oil

2.4.2 初始pH值的確定

圖4 初始pH值對魚油提取率的影響Fig.4 Effect of initial pH on the extraction rate of fish oil

響，有時(shí)隨著底物種類和濃度的改變也會發(fā)生變化。從圖4可以看出，當(dāng)初始pH值在7.0時(shí)，魚油提取率達(dá)到最大，因此，把水解液的最適初始pH值確定為7.0。

2.4.3 酶解溫度的確定

以酶解溫度為橫坐標(biāo)、魚油提取率為縱坐標(biāo)，繪制酶解溫度與魚油提取率關(guān)系曲線，如圖5所示。在酶解過程中，隨著溫度的逐漸升高，酶促反應(yīng)速率加快，而且在溫度較高的情況下，有利于破乳，魚油容易分離。另一方面，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，酶蛋白逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率下降[13]，而且溫度過高也不利于魚油的品質(zhì)。由圖5可以看出，當(dāng)酶解溫度在55℃時(shí)，魚油提取率最大，因此把酶解溫度確定在55℃。

圖5 酶解溫度對魚油提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of fish oil

2.4.4 加酶量的確定

以加酶量為橫坐標(biāo)、魚油提取率為縱坐標(biāo)，繪制加酶量與提油率的關(guān)系曲線，如圖6所示。隨著加酶量的增加，魚油提取率逐漸上升，當(dāng)加酶量達(dá)到3000U/g以后，由于底物濃度的下降，魚油提取率增加趨于平緩?？紤]到生產(chǎn)成本和反應(yīng)速率等綜合因素，酶的添加量確定在3000U/g。

圖6 加酶量對魚油提取率的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on the extraction rate of fish oil

2.4.5 液料比的確定

以液料比為橫坐標(biāo)、魚油提取率為縱坐標(biāo)，繪制液料比與魚油提取率關(guān)系曲線，如圖7所示。當(dāng)液料比較小時(shí)，底物濃度高，物料黏稠，分散不均勻，過多底物聚集于酶的活力中心，從而影響酶催化速度，使魚油提取率下降[14]；液料比過大的話，導(dǎo)致酶和底物的濃度降低，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，魚油提取率下降，而且增加后期離心分離的難度，因此將液料比確定為1:1。

圖7 液料比對魚油提取率的影響Fig.7 Effect of water-to-material ratio on the extraction rate of fish oil

2.5 水酶法提油工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定液料比為1:1，以魚油提取率為評價(jià)指標(biāo)，采用L9(34) 正交試驗(yàn)考察加酶量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)和初始pH值(D)4個(gè)因素對魚油提取率的影響，以確定最佳的提油工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分別見表3、4。

表3 工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table3 Factors and levels of orthogonal test

表4 工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table4 Results and analysis of orthogonal test

由正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析(表4)可知，4因素對酶

法提取斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟油工藝的影響大小依次為初始pH值＞加酶量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度，極差分析得到的最優(yōu)水平組合為A1B2C1D1，而由正交試驗(yàn)的直接結(jié)果來看，最優(yōu)水平組合是第一組A1B1C1D1。對A1B2C1D1和A1B1C1D1進(jìn)行驗(yàn)證對比實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果為：A1B2C1D1和A1B1C1D1的魚油提取率分別為84.47%和80.94%，兩者不存在顯著差異，但對比這兩種提取工藝，A1B2C1D1酶解時(shí)間較長(需要1.5h)，而A1B1C1D1的酶解時(shí)間較短(僅需0.5h)，因此從提高工藝能效和魚油質(zhì)量的角度考慮，選擇最佳工藝條件為A1B1C1D1，即料液比為1:1、加酶量3500U/g、酶解時(shí)間0.5h、酶解溫度55℃，初始pH7.5。

2.6 粗魚油理化性質(zhì)測定

最佳提取條件下得到的粗魚油外觀呈黃褐色，具有魚腥味和輕微的酸敗味，理化性質(zhì)分析見表5。由表5可知，粗魚油的過氧化值較低，達(dá)到粗油的一級標(biāo)準(zhǔn)，但酸值相對較高(35.95mg/g)，超出粗油的二級標(biāo)準(zhǔn)，可能是魚油提取過程中，部分魚油發(fā)生水解而導(dǎo)致酸值過大。另外，粗魚油中還含有一定量的水分，蛋白質(zhì)、膽固醇及色素等非甘油酯成分，這些雜質(zhì)成分不僅影響魚油的穩(wěn)定性，而且還會影響魚油的深加工，因此還需要進(jìn)一步通過精煉工藝(如脫膠、脫酸、脫色、脫臭和冬化等)進(jìn)行精制，從而提高魚油的質(zhì)量，以達(dá)到工業(yè)或食用的目的。

表5 鮰魚內(nèi)臟粗魚油的理化性質(zhì)Table5 Physics and chemistry indexes of crude fish oil from channel catfish

2.7 斑點(diǎn)叉尾鮰魚油脂肪酸組成分析

對提取的魚油進(jìn)行氣相色譜分離，并采用質(zhì)譜儀分析，結(jié)果見表6。斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟魚油主要由C14～C22，共19種脂肪酸組成，其中SFA(飽和脂肪酸)6種、MUFA (單不飽和脂肪酸)5種、PUFA(多不飽和脂肪酸)8種。粗魚油中的UFA(不飽和脂肪酸)含量較高，達(dá)到78.59%，其中PUFA含量達(dá)到16.83%，而EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)含量較低，分別為0.63%、 0.93%，這主要是因?yàn)榘唿c(diǎn)叉尾鮰屬于一種淡水魚類(淡水魚體內(nèi)EPA和DHA的含量一般均較低)，此外其體內(nèi)的EPA和DHA含量還與其生活的水體環(huán)境及攝食的飼料有關(guān)[15]。

海水魚油中的C18、C20、C22脂肪酸含量相對較高，而淡水魚油中的C20、C22不飽和脂肪酸較少，但含有較多的C16飽和脂肪酸和C18不飽和酸[16]。與之相似，斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟魚油中主要的脂肪酸種類是C16:0、C18:2n-7、C18:1n-9、C18:0，其含量分別為11.88%、13.24%、54.36%、5.86%。n-3系與n-6系多不飽和脂肪酸含量的比值(∑n-3/∑n-6)是比較魚油相對營養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)，通常認(rèn)為達(dá)到1:1以上為好[17]，而斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟魚油中的∑n-3/∑n-6的比值達(dá)到3.63，遠(yuǎn)高于鰱魚、草魚和羅非魚等其他淡水魚類[18]。

表6 斑點(diǎn)叉尾鮰魚油的脂肪酸組成Table6 Fatty acids composition of fish oil from channel catfish

3 結(jié) 論

斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟的粗蛋白含量僅為8.58%，而脂肪含量達(dá)到28.14%，是加工魚油的良好來源。酶法提取斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟油的最佳的工藝條件為初始pH7.5、料液比1:1、加酶量3500U/g、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間

0.5h，在此條件下，魚油提取率達(dá)到80.94%。在最佳提取條件下得到的粗魚油外觀呈黃褐色，具有魚腥味和輕微的酸敗味，對其理化性質(zhì)進(jìn)行分析表明，酸值相對較高，因此還需要進(jìn)一步的精煉，以達(dá)到工業(yè)化或食用的目的。經(jīng)GC-MS檢測分析，酶法提取的粗魚油中至少含有19種脂肪酸，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別為19.42%和78.59%，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別為61.76%和16.83%，EPA和DHA的含量分別為0.63%、0.93%，而∑n-3/∑n-6的值達(dá)到3.63。

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Aqueous Enzymatic Extraction of Fish Oil from Viscera of Channel Catfish (Ictalurus punctatus)

LU Jian-feng，LIN Lin，ZHANG Wei-wei，WENG Shi-bing，YE Ying-wang，JIANG Shao-tong
(College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Fish oil was extracted from the viscera of channel catfish (Ictalurus punctatus) by aqueous enzymatic extraction method. The optimum extraction parameters were as follows: initial hydrolysis pH 7.5, ratio of viscera to water 1:1, amount of papain 3500 U/g, hydrolysis temperature 55 ℃, hydrolysis time 0.5 h. Under these conditions, the extraction ratio of fish oil was up to 80.94%. The extracted fish oil (namely crude fish oil) was yellow-brown in appearance with fishy smell and light rancidity odor, and it had a lower peroxide value and high acid value. The relative content of the saturated fatty acids accounted for 19.42% of the total fatty acids. The relative content of monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids were 61.76% and 16.83%, respectively. The ratio of n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acids is 3.63. The above results show that the viscera of channel catfish are a good resource for fish oil production.

Ictalurus punctatus；viscera；fish oil；aqueous enzymatic extraction method

TQ460.6

A

1002-6630(2010)22-0075-06

2010-07-15

安徽省重大科技攻關(guān)專項(xiàng)(08010301078)；國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2008GA710021)

陸劍鋒(1976—)，男，副研究員，博士，主要從事水生動物資源的保護(hù)和綜合利用研究。E-mail：lujf@sibs.ac.cn