袁 偉，唐善虎*，岑璐伽，李 雪，陳 諾，羅 薇

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

PCR法檢測肉鴨屠宰加工生產(chǎn)鏈中沙門氏菌的污染

袁 偉，唐善虎*，岑璐伽，李 雪，陳 諾，羅 薇

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

為建立肉鴨加工中快速、準(zhǔn)確的沙門氏菌PCR檢測方法，并應(yīng)用于肉鴨屠宰生產(chǎn)加工鏈沙門氏菌的實(shí)時(shí)監(jiān)測。采用Primer Premier 5.0軟件針對沙門氏菌特有的fimY基因設(shè)計(jì)合成一對引物5′- GCATTCCGCTCATTAGAT-3′和5′-TGGAGGCTGATAACAAGG-3′，并對沙門氏菌DNA擴(kuò)增PCR體系的退火溫度、引物濃度、Mg2+濃度和聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：成功擴(kuò)增出沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株的275bp目的片段，靈敏度達(dá)到了1.2pg；應(yīng)用建立的PCR方法對國內(nèi)某典型肉鴨屠宰廠的肉鴨屠宰鏈環(huán)節(jié)進(jìn)行沙門氏菌污染的檢測，發(fā)現(xiàn)在屠宰環(huán)境、拔毛浸燙水、浸蠟冷卻水、清洗池水、宰前毛、食道、糞便和瀝水體腔內(nèi)共有25個樣品中擴(kuò)增出了275bp大小的特異性片段，而空白對照無擴(kuò)增條帶。

肉鴨；PCR；沙門氏菌；檢測；生產(chǎn)鏈

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌，是引起食物中毒的主要病原之一[1]。沙門氏菌主要以動物的肉、蛋和奶為污染對象，在動物性食品的加工、貯藏、運(yùn)輸和銷售等各個環(huán)節(jié)中能夠?qū)е庐a(chǎn)品的污染，是動物性食品行業(yè)的巨大安全隱患。如何有效開展對沙門氏菌進(jìn)行檢測和監(jiān)控是一項(xiàng)十分有意義的工作。

現(xiàn)階段檢測沙門氏菌的方法主要有傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢測的方法、PCR方法和免疫學(xué)方法。免疫學(xué)方法準(zhǔn)確、靈敏度相對較低、卻成本較高；傳統(tǒng)的沙門氏菌檢驗(yàn)方法費(fèi)時(shí)、操作繁瑣，難以應(yīng)對食品中沙門氏菌污染的快

速診斷及食品生產(chǎn)加工過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)控的需要。PCR法檢測沙門氏菌是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的新方法，在食品檢測中有著十分廣泛的應(yīng)用。目前，雖然已經(jīng)應(yīng)用于乳品、肉品等食品中沙門氏菌的檢測，并建立了相應(yīng)的方法[2-3]，但是主要針對沙門氏菌的invA基因[4]、hilA基因[5]、fimA基因[6]和stn基因[7]等靶基因進(jìn)行檢測。其中，利用invA基因進(jìn)行檢測的方法普遍。隨著對PCR檢測技術(shù)研究的深入，用invA基因所設(shè)計(jì)的引物的靈敏度和特異性不能滿足現(xiàn)階段的檢測的要求[8]，如何篩選新的引物和建立新的PCR檢測方法顯得十分重要。另外，在豬肉和雞肉的生產(chǎn)加工過程中，已經(jīng)報(bào)道有加工過程的沙門氏菌的檢測研究[9-11]，但是，在鴨肉的生產(chǎn)過程中尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究的目的是為肉鴨加工業(yè)建立一個快速準(zhǔn)確的沙門氏菌檢測方法，并應(yīng)用于肉鴨屠宰生產(chǎn)加工鏈沙門氏菌的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

樣品：肉鴨 某肉鴨加工企業(yè)。

菌株：沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株C79-13、DY60沙門氏菌分離菌株、DT4沙門氏菌分離菌株、NO44志賀氏菌分離菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25923 中國藥品生物制品檢定所。

引物：在NCBI數(shù)據(jù)庫[12]中搜索沙門氏菌特有的hilA基因序列及fimY基因序列，并分別對比其同源性，選取保守區(qū)域的一段核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了1對引物，設(shè)計(jì)引物選用primer 5(V5.0)軟件，由Invitrogen公司合成。引物序列如下：

1.1.2 試劑與儀器

10×PCR buffer(Mg2+free)、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)、MgCl2(25mmol/L)、r-Taq DNA(5 U/μL)聚合酶 大連寶生物工程公司；DNA MarkerⅠ 北京天根生化科技有限公司；GoldViewTM核酸染料、BestaTM瓊脂糖 北京賽百勝基因技術(shù)有限公司；SS固體培養(yǎng)基、SC液體培養(yǎng)基 杭州天和微生物試劑有限公司。

PCR儀、移液器、低溫離心機(jī)、核酸蛋白測定儀德國Eppendorf公司；超低溫冰箱 美國Thermo公司；水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；生物安全柜 Baker公司。

1.2 PCR方法的建立

1.2.1 沙門氏菌培養(yǎng)和樣品中沙門氏菌增菌

將－80℃凍存的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株取出，在無菌操作臺中操作。取5mL LB液體培養(yǎng)基加至10mL EP管中，用接種環(huán)挑取沙門氏菌菌液于LB培養(yǎng)基，置于水浴振蕩器中(37℃，200r/min)振蕩12h。將培養(yǎng)的菌液劃線接種至LB平板培養(yǎng)基，接種完后倒置平板5min，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，至平板出現(xiàn)明顯菌落后用接種環(huán)挑取單一菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基，置于水浴振蕩器(37℃，200r/min)振蕩過夜，備用。

在肉鴨屠宰線樣品增菌中，取液體樣品1mL或取固體樣品1cm×1cm×1cm加入裝有5mL LB培養(yǎng)基的離心管中，置水浴振蕩器，在37℃、220r/min培養(yǎng)24h，備用。

1.2.2 沙門氏菌基因組DNA的抽提

沙門氏菌菌液(3.4×107CFU/mL)經(jīng)離心和蛋白酶消化，采用酚氯仿法進(jìn)行提取[13]。

1.2.3 沙門氏菌基因組DNA質(zhì)量濃度測定

取1μL DNA加69μL滅菌蒸餾水作為待測樣品，對照組取70μL滅菌蒸餾水，在紫外核酸定量儀上測定OD260和OD280的光密度，計(jì)算DNA的質(zhì)量濃度。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

以沙門氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將影響反應(yīng)條件的Mg2+(1、1.5、2μL)、引物濃度(0.5、1、1.5、2μL)、r-Taq DNA(0.2、0.5μL)聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，最終得出以下最優(yōu)PCR反應(yīng)體系(25μL體系)10×PCR buffer 2.5μL、Mg2+(20mmol/L)2μL、dNTP Mixture(各10mmol/L)2μL、模板DNA 1μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、r-Taq DNA聚合酶0.2μL、用滅菌去離子水補(bǔ)齊25μL。

對退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化，從引物Tm值(53±5)℃進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化溫度分別為47.0、48.9、50.4、52.0、53.8、56.3、57.7℃，最終得到最適合的反應(yīng)溫度52.0℃。PCR擴(kuò)增反應(yīng)最優(yōu)條件如下：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、40個循環(huán)，72℃終延伸5min。

反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 特異性檢測

分別將沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C79-13、沙門氏菌DT4分離菌株、沙門氏菌DY60分離菌株、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)、志賀氏菌NO44分離菌株為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同1.2.4節(jié)，反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 靈敏度檢測

將沙門氏菌基因組DNA以十倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，分別取1μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同1.2.4節(jié)，反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 肉鴨屠宰鏈中沙門氏菌污染的檢測

1.3.1 采樣

在某肉鴨加工企業(yè)，根據(jù)HACCP原則[14]，選取生產(chǎn)控制關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)采樣、檢測。首先對環(huán)境進(jìn)行樣品的采集，用棉簽蘸取屠宰場地面作為樣品，取3個平行樣品；然后，對宰前鴨隨機(jī)采集鴨子的毛發(fā)5個平行樣；最后，對屠宰加工流程中主要環(huán)節(jié)進(jìn)行隨機(jī)取樣：①拔毛：拔毛過程中采3個浸燙用水平行樣；②浸蠟：浸蠟池的冷卻槽，采3個平行水樣；③驗(yàn)毛：驗(yàn)毛池內(nèi)取水樣3個；④掏膛：選取掏膛過程中開膛后鴨子的食道、小腸、大腸、大腸內(nèi)容物(糞便)裝入離心管，用封口膠封口，采5個平行樣品；⑤清洗：在清洗池內(nèi)取3個水樣；⑥瀝水：取瀝水后的鴨子皮膚、肌肉5個平行樣。其中拔毛、浸蠟、驗(yàn)毛、清洗環(huán)節(jié)樣品為液體樣品，裝入100mL塑料瓶，而掏膛、瀝水環(huán)節(jié)樣品為固體樣品，裝入10mL離心管。所有樣品用封口膠封口，備用。

1.3.2 PCR樣品制備

待測樣品的制備參照徐德順等[15]和鐘偉軍等[16]報(bào)道的方法進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)室樣品處理過程，均在無菌條件下操作，將樣品取1cm×1cm×1cm左右大小裝入10mL離心管，再加入5mL生理鹽水后勻漿成懸液，隔水煮沸20min，12000r/min離心15min后取上清液作為檢測模板；水樣則直接用作DNA提取。

1.3.3 PCR檢測

檢測方法同1.2.4節(jié)，反應(yīng)結(jié)束后取5μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量濃度的確定

取1μL DNA加69μL滅菌蒸餾水作為待測樣品，對照組取70μL滅菌蒸餾水，在核酸蛋白測定儀上測定OD260和OD280的光密度值，OD260/OD280=1.85，測得沙門氏菌基因組DNA的質(zhì)量濃度為1200μg/mL。

2.2 特異性檢測

沙門氏菌PCR特異性PCR產(chǎn)物(fimY引物)用2%的瓊脂糖凝膠(含1μL GoldView)，在100V電壓條件下電泳30min，結(jié)果如圖1所示。PCR電泳結(jié)果顯示，只有沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株有擴(kuò)增條帶，其他菌株(金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922、志賀桿菌分離株NO44)無條帶擴(kuò)增，說明改進(jìn)的PCR法有較高的特異性。

圖1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Experimental results for detection specificity

2.3 靈敏度檢測

沙門氏菌模板DNA梯度稀釋PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠，結(jié)果如圖2所示。PCR電泳結(jié)果表明，采用fimY引物擴(kuò)增的最低檢測限為模板DNA稀釋至10-6，最低DNA的檢出量為1.2pg。

圖2 靈敏度測定結(jié)果Fig.2 Determination results of detection limit

2.4 樣品檢測結(jié)果

環(huán)境水樣、拔毛浸燙水樣、浸蠟冷卻水樣、驗(yàn)毛池水樣、清洗池水樣、宰前毛樣、食道樣、小腸樣、瀝水肉樣和瀝水皮膚樣前增菌后PCR產(chǎn)物分別電泳，結(jié)果見圖3。

圖3A顯示環(huán)境水樣PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示增菌后1至3號樣品均為沙門氏菌陽性；圖3B PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明增菌后拔毛浸燙水1至3號樣品均為陽性；由圖3C可以看出，增菌后浸蠟冷卻水1、2號樣品為陽性，而3號樣品為陰性；圖3D顯示增菌后驗(yàn)毛池水1～3號樣品均不帶菌，為陰性結(jié)果；圖3E所示的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示增菌后清洗池水1～3號樣品顯示陽性結(jié)果；

圖3F表明增菌后宰前毛1～5號樣品為陽性帶菌；圖3G結(jié)果顯示增菌后食道2號和6號樣品為陽性結(jié)果，1、3～5號樣品為陰性；圖3H結(jié)果顯示增菌后小腸4號樣品為陽性，而1～3號和5號樣品為陰性；圖3I結(jié)果表明增菌后瀝水肉3～5號樣品為陽性，而1號和2號樣品為陰性；圖3J結(jié)果顯示增菌后瀝水皮膚1～5號樣品均不帶菌，為陰性。整個屠宰鏈沙門氏菌檢出情況見表1。

圖3 各樣品PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products from each sample

表1 屠宰環(huán)節(jié)樣品沙門氏菌污染情況Table1 Contamination status of duck-slaughtering chain by Salmonella typhimurium

2.5 討 論

檢測沙門氏菌的方法主要有PCR方法，該法所采用的靶基因主要有invA基因[4]、hilA基因[5]、fimA基因[6]和stn基因[7]等。本實(shí)驗(yàn)選取了沙門氏菌DNA中高度保

守的fimY基因[17-18]序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，采用PCR方法原理建立了肉鴨沙門氏菌檢測方法。

在PCR擴(kuò)增中對影響擴(kuò)增效果的幾個因素進(jìn)行優(yōu)化處理[19]，包括引物濃度、Mg2+濃度、酶的用量和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，該研究中設(shè)計(jì)的引物的特異性都很高，PCR結(jié)果顯示沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和沙門氏菌分離菌株(DY60、DT4)均顯示出陽性結(jié)果，而金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 25923)、志賀桿菌分離菌株(NO44)、大腸桿菌(ATCC 25922)均顯示陰性。針對fimY基因設(shè)計(jì)的引物靈敏度達(dá)到了1.2pg，優(yōu)于江樹勛等[20]建立的PCR檢測沙門氏菌的方法的檢測限。

禽類在屠宰過程中，容易受到沙門氏菌污染的環(huán)節(jié)有自身原料帶菌污染、屠宰環(huán)境不潔造成污染、屠宰器械及操作臺面消毒不徹底造成交叉污染、以及人手在操作過程中污染[21]。根據(jù)HACCP原則，本實(shí)驗(yàn)樣品采集選取鴨肉屠宰生產(chǎn)鏈的幾個重要的環(huán)節(jié)，分別為環(huán)境、宰前鴨毛、拔毛浸燙水、浸臘冷卻水、驗(yàn)毛池水、清洗池水，瀝水后皮膚、瀝水后腹腔肉這幾個容易產(chǎn)生污染的關(guān)鍵點(diǎn)收集試驗(yàn)樣品[11]，檢測結(jié)果讓人十分擔(dān)心。發(fā)現(xiàn)鴨子屠宰前的鴨毛上、屠宰時(shí)拔毛使用的浸燙用水、浸蠟冷卻用水、清洗池水、以及瀝水后胴體腔內(nèi)的肉樣均檢測出了沙門氏菌，說明整個生產(chǎn)鏈中均存在著沙門氏菌的污染。

本結(jié)果顯示所使用的活鴨就存在沙門氏菌的污染，在拔毛浸燙池水的3個樣品中全部檢出了沙門氏菌，在5個瀝水后體腔樣品中有3例檢出了沙門氏菌。這將對繼后的生產(chǎn)衛(wèi)生可能產(chǎn)生比較嚴(yán)重的問題。

由于各個屠宰場的規(guī)模不一樣，各個環(huán)節(jié)流程可能也與標(biāo)準(zhǔn)有所差別，在清洗預(yù)冷的這一道工序，標(biāo)準(zhǔn)的屠宰工藝是有預(yù)冷這一道工序的，但是在這家屠宰廠沒有見到預(yù)冷池，清洗完的肉鴨胴體瀝水后則直接入庫了。本實(shí)驗(yàn)采集了清洗池內(nèi)的水和瀝過水的皮膚和體腔肉作為樣品檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清洗池3個水樣都顯陽性，說明清洗池存在著沙門氏菌的污染；皮膚上沒有檢出沙門氏菌；體腔的5個肉樣3個樣品顯陽性。在肉鴨屠宰工藝流程上預(yù)冷工序的好壞直接影響產(chǎn)品質(zhì)量[12]，屠宰完成后要將樣品迅速的降到4℃左右方能保證肉質(zhì)在較高的水平上[22]。另外在預(yù)冷水中還要加入一定濃度的次氯酸鈉進(jìn)行殺菌，以減少胴體上微生物的生長。該廠沒有預(yù)冷池，對產(chǎn)品質(zhì)量的控制顯然不夠高，在檢測中發(fā)現(xiàn)了較高比例的沙門氏菌的污染，說明這一環(huán)節(jié)的控制是影響屠宰后肉質(zhì)質(zhì)量的重點(diǎn)，應(yīng)引起足夠多的重視。

在屠宰生產(chǎn)過程中在某些需要人工操作的環(huán)節(jié)中，工人的素質(zhì)直接影響到產(chǎn)品的質(zhì)量好壞。在采樣中發(fā)現(xiàn)有個別工人沒有帶手套進(jìn)行操作，在浸臘冷卻池和清洗池內(nèi)洗手，這些違規(guī)的操作直接導(dǎo)致產(chǎn)品的污染，并且有可能污染整個生產(chǎn)線。在禽類屠宰加工工藝的摘取內(nèi)臟的環(huán)節(jié)中，應(yīng)注意避免劃破腸道導(dǎo)致胴體體腔內(nèi)的污染，在采樣的過程中發(fā)現(xiàn)還是有較多的劃破腸道情況，直接造成內(nèi)臟污染的情況出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)在消化道、腸道樣品的檢測中，5例食道樣品1例呈陽性、5例小腸樣品1例呈陽性、5例大腸樣品3例陽性、5例糞便樣品3例陽性。這可能是因?yàn)楣と嗽谡齼?nèi)臟時(shí)腸道被劃破，并且腸道并沒有分開放置，造成了各臟器的交叉污染。

3 結(jié) 論

3.1 根據(jù)Genbank已公布的fimY基因序列分別設(shè)計(jì)了一對特異性引物，通過優(yōu)化的PCR條件成功建立了檢測沙門氏菌的方法，目的擴(kuò)增片段為275bp，在大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、志賀桿菌(NO44)、空腸彎曲菌的PCR反應(yīng)中呈陰性，而在沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株(C79-13)及2株分離株的PCR反應(yīng)中呈陽性，表現(xiàn)出了較高的特異性，且檢測限達(dá)到了1.2pg，通過菌液PCR和菌落計(jì)數(shù)，得到最低能檢測到的菌落數(shù)為340CFU/mL。

3.2 通過建立的沙門氏菌PCR檢測方法檢測了肉鴨屠宰鏈不同環(huán)節(jié)的50個樣品，共檢測出25個陽性結(jié)果，陽性率為50%。

3.3 檢測結(jié)果顯示，在肉鴨屠宰過程中，存在著多處沙門氏菌的污染，屠宰環(huán)境、宰前毛、拔毛浸燙水、清洗池水、瀝水后體腔肉污染嚴(yán)重；缺少預(yù)冷工序和屠宰過程中工人違規(guī)操作會導(dǎo)致肉鴨屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌嚴(yán)重污染。

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Detection of Salmonella typhimurium in Duck-slaughtering Chain by PCR

YUAN Wei，TANG Shan-hu*，CEN Lu-jia，LI Xue，CHEN Nuo，LUO Wei
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

In order to establish a rapid and accurate detection method of Salmonella typhimurium contamination in duck-slaughtering chain, PCR was used to monitor duck-slaughtering chain in real time. A pair of primers 5＇-GCA TTCCGCTCATTAGAT-3＇and 5＇-TGGAGGCTGATAACAAGG-3＇ were designed to amplify fimY gene by PCR according to the published fimY gene sequence of Salmonella typhimurium. PCR reaction conditions were optimized. Results indicated that a fragment with 275 bp in length was amplified in both standard strain and isolated strain of Salmonella typhimurium. The detection limit of PCR assay was 1.2 pg. This established PCR method was used for the detection of Salmonella typhimurium in a typical duck-slaughtering chain. Totally 25 samples from plucking pool, cooling wax pool, cleaning pool, feathers, esophagus, intestine, colorectal feces, and dripping peritoneal were amplified to produce the 275 bp fragment. In contrast, no amplified fragment was achieved in the negative control. In the present study, a PCR assay was first developed for the detection of Salmonella typhimurium in duckslaughtering chain and typical duck-slaughtering chain with serious contamination of Salmonella typhimurium was observed. These results provided a practical application and useful guidance to the management of duck meat production and food safety.

duck；PCR；Salmonella typhimurium；detection；duck-slaughtering chain

R155.55

A

1002-6630(2010)22-0326-06

2010-07-04

西南民族大學(xué)資助項(xiàng)目

袁偉(1985—)，男，碩士，研究方向?yàn)槭称沸l(wèi)生與安全。E-mail：warrior101@163.com

*通信作者：唐善虎(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)和食品安全。E-mail：stang01@126.com