黃進(jìn)慧，高向陽(yáng)*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

固相萃取-流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定雞蛋中的沙拉沙星

黃進(jìn)慧，高向陽(yáng)*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

建立一種簡(jiǎn)便、高靈敏度的測(cè)定雞蛋中沙拉沙星的新方法?；谏忱承菍?duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系有顯著增敏作用的研究，雞蛋樣品中的沙拉沙星用磷酸鹽提取，固相萃取C18小柱凈化，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，建立測(cè)定雞蛋中沙拉沙星的新方法。結(jié)果表明，方法的線性范圍為6×10-9～6×10-5mol/L，檢出限為3.97×10-11mol/L，平均回收率為96.2%，RSD為1.71%(n=11)，結(jié)果令人滿意。

固相萃??；流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光；沙拉沙星；雞蛋

沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)屬于第三代氟喹諾酮類藥物，化學(xué)名為1-對(duì)氟苯基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，是含氟的喹諾酮類衍生物中最具抗菌活性的藥物之一。沙拉沙星為獸醫(yī)專用抗菌藥，具有較強(qiáng)的殺菌能力，對(duì)絕大部分革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌及支原體均有抑殺作用，因此在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。但使用沙拉沙星藥物會(huì)引起諸多不良反應(yīng)，如消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不適，引起致畸、致突變作用[1]，且藥物殘留也會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性，威脅消費(fèi)者身體健康，因此建立合適的檢測(cè)方法是非常必要的。

目前，沙拉沙星的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[2-3]、HPLC-MS/MS法[4-5]、紫外分光光度法[6-7]、熒光分光光度法[8-10]、免疫學(xué)檢測(cè)方法[11]等。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高，分析速度快，重現(xiàn)性好的顯著特點(diǎn)，已經(jīng)在藥品、食品等領(lǐng)域得到較廣泛的應(yīng)用[12-15]，而流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定雞蛋中沙拉沙星的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沙拉沙星可顯著增敏魯米諾-鐵氰化鉀體系的發(fā)光強(qiáng)度，建立了流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光快速測(cè)定SAR的方法，用于雞蛋中的沙拉沙星含量的測(cè)定，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的顯著特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售雞蛋和自養(yǎng)雞所產(chǎn)的蛋。

6×10-4mol/L沙拉沙星(SAR)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取105℃烘干的SAR(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量99.6%) 0.0116g，溶于少量0.1mol/L 氫氧化鈉溶液中，用重蒸水定容至50mL棕色容量瓶中，4℃冰箱保存，用時(shí)逐

級(jí)稀釋至所需濃度；磷酸鹽PBS緩沖液(pH7.0)：稱取NaH2PO40.78g，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL，用二次蒸餾水定容至100mL；5.0×10-2mol/L魯米諾(luminol)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取魯米諾0.8858g，用0.1mol/L氫氧化鈉溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，混勻避光保存，兩周后使用；0.1mol/L鐵氰化鉀溶液。

甲醇、正己烷為色譜純?cè)噭?，其他試劑均為分析純，水為二次亞沸蒸餾水；所有玻璃器皿用5%硝酸浸泡5h以上，用二次亞沸蒸餾水洗凈后投入使用。

1.2 儀器與設(shè)備

IFFL-D流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀 西安瑞邁電子科技有限公司；SYZ-B型石英亞沸高純水蒸餾器 江蘇宜興市勤華石英玻璃儀器廠；pH213型酸度計(jì) 意大利哈納儀器有限公司；固相萃取裝置及C18固相萃取小柱(200mg/3mL) 安捷倫公司；離心機(jī)。

1.3 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定法

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光反應(yīng)裝置如圖1所示，在設(shè)定的工作參數(shù)下預(yù)熱和走基線，魯米諾與鐵氰化鉀在線混合，樣品液通過(guò)進(jìn)樣閥注入，溶液混合后在流通池中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，記錄化學(xué)發(fā)光反應(yīng)信號(hào)，以相對(duì)峰高定量。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection-chemiluminescence analysis

1.4 雞蛋樣品前處理

1.4.1 試樣的制備

取雞蛋2～4枚，去蛋殼，用食品均質(zhì)器處理3min后，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。室溫解凍，稱樣2g左右(精確到0.0001g)于50mL聚丙烯離心管中，加PBS緩沖液3.0mL，振蕩混合10min，5000r/min離心10min，上層液移入另一干凈的離心管中。殘?jiān)瓷鲜霾襟E重復(fù)提取1次，合并上層清液，加入3mL正己烷，混合5min，5000r/min離心10min，小心吸去上層乳黃色絮狀物，下層液再加入3mL正己烷，重復(fù)脫脂一次后，下層液供SPE凈化。

1.4.2 SPE凈化

C18小柱用3mL甲醇和3mL重蒸水活化后，移取樣品提取液3mL加入已活化的SPE小柱中，緩慢通過(guò)小柱；用10%(V/V)甲醇溶液3mL淋洗，抽干；3mL甲醇洗脫，抽干，收集洗脫液。洗脫液于60～70℃氮?dú)獯抵两桑枚蝸喎姓麴s水溶解殘留物，轉(zhuǎn)移并定容到25mL棕色容量瓶里，供流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定條件的選擇

2.1.1 化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)的設(shè)定

在光電倍增管負(fù)高壓－400V、增益2的條件下，對(duì)儀器工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)表明：儀器在表1參數(shù)下運(yùn)行，發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定，且具有最大的信噪比。

表1 化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)的設(shè)定Table1 Working parameters for chemiluminescence instrument

2.1.2 魯米諾分析液的pH值和濃度選擇

實(shí)驗(yàn)選用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Na2CO3-NaHCO3等溶液調(diào)節(jié)魯米諾溶液的pH值，發(fā)現(xiàn)在NaOH溶液中化學(xué)發(fā)光信號(hào)較強(qiáng)，故選用NaOH調(diào)節(jié)魯米諾的pH值。當(dāng)固定魯米諾濃度2×10-4mol/L、鐵氰化鉀濃度5×10-4mol/L、沙拉沙星分析液濃度1×10-6mol/L時(shí)、魯米諾的pH值對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響如圖2所示。

圖2 魯米諾的pH值對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH of luminol solution on the relative chemiluminescence intensity

由圖2可知，魯米諾pH值為13.30時(shí)，發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)。因此，選定魯米諾的pH值為13.30進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

考察5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)魯米諾溶液對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。發(fā)現(xiàn)隨魯米諾濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度隨之增大，基線也隨之顯著升高，當(dāng)魯米諾濃度為1×10-4mol/L時(shí)，信噪比最大，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較穩(wěn)定，綜合考慮，選用此濃度進(jìn)行測(cè)定。

2.1.3 鐵氰化鉀濃度的選擇

按表1工作參數(shù)，在1×10-6mol/L沙拉沙星、1×

10-4mol/L魯米諾(pH13.30)條件下，鐵氰化鉀濃度對(duì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響見圖3。因此，選擇鐵氰化鉀溶液的最佳濃度為5×10-4mol/L。

圖3 鐵氰化鉀濃度對(duì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of potassium ferricyanide concentration on the relative chemiluminescence intensity

2.1.4 沙拉沙星分析液pH值的選擇

實(shí)驗(yàn)分別在酸性、近中性和堿性條件下考察沙拉沙星分析液pH值對(duì)整個(gè)體系相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。發(fā)現(xiàn)在酸性條件下相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較小，靈敏度較低；堿性條件下，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較大，但信號(hào)不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差；而用pH6.8～7.2的重蒸水定容時(shí)，試液的相對(duì)發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定、適中，重現(xiàn)性好。因此，選用重蒸水定容沙拉沙星分析液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

圖4 沙拉沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of sarafloxacin

如圖4所示，在選定實(shí)驗(yàn)條件下，沙拉沙星濃度在6×10-9～6×10-5mol/L范圍內(nèi)與相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝0.033x＋3899.1，相關(guān)系數(shù)r為0.9962。對(duì)1×10-6mol/L的SAR標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.71%；以3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算的檢出限為3.97×10-11mol/L(n＝8)。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，研究樣品中可能的共存物對(duì)沙拉沙星測(cè)定的影響。結(jié)果表明：對(duì)1×10-6mol/L的沙拉沙星，500倍的50倍的Na+、倍的5倍的Mg2+、 Mn2+不干擾測(cè)定。

2.4 測(cè)定結(jié)果及回收率

雞蛋樣品隨機(jī)分組、編號(hào)后，按照1.4節(jié)前處理方法處理并進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，按選定的條件進(jìn)行流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果及回收率實(shí)驗(yàn)Table2 Spike recoveries of sarafloxacin in eggs

由表2可知，樣品的加標(biāo)回收率在88.7%～107.2%之間，平均回收率為96.2%。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)確定用磷酸鹽緩沖液和正己烷處理雞蛋樣品，除去蛋白質(zhì)和脂肪類干擾成分后，再用固相萃取C18小柱凈化試液。根據(jù)沙拉沙星對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系的增敏作用，建立一種靈敏度高、線性范圍廣及操作簡(jiǎn)便的固相萃取-流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定雞蛋樣品中沙拉沙星的新方法。方法的線性范圍為6×10-9～6× 10-5mol/L，檢出限為3.97×10-11mol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.71%(n=11)，平均回收率為96.2%，用于實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

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Use of Solid Phase Extraction - Flow Injection- Chemiluminescence for Determination of Sarafloxacin in Eggs

HUANG Jin-hui，GAO Xiang-yang*
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A high sensitive and fast method was developed for determination of sarafloxacin(SAR) in eggs. Sarafloxacin in sample was extracted with phosphate, and purified by solid phase extraction (SPE). Since sarafloxacin could significantly enhanced the reaction between luminol and potassium ferricyanide, it could be detected by flow injection-chemiluminescence method. The linear ranges of this method was 6×10-9－6×10-5mol/L, and the detection limit was 3.97×10-11mol/L. The average recovery was 96.2%, and the relative stand deviation (RSD) was 1.71%(n=11).

solid phase extraction；flow injection-chemiluminescence；sarafloxacin；eggs

O657.3；R917

A

1002-6630(2010)22-0372-03

2010-02-01

河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2007550008)

黃進(jìn)慧(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品安全研究。E-mail：hjh116@163.com

*通信作者：高向陽(yáng)(1949—)，男，教授，主要從事儀器分析、食品安全分析研究。E-mail：ndgaoxy@163.com