宋宏新，潘 潔，柏紅梅，薛海燕

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)牛乳β-酪蛋白的檢測(cè)

宋宏新，潘 潔，柏紅梅，薛海燕

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

通過確定包被抗體最佳稀釋度(anti-β-CN IgY 1:160)、封閉液及封閉時(shí)間(含1%明膠的PBST，封閉1h)、酶標(biāo)抗原(1:20)和待測(cè)脫脂牛乳樣品稀釋液(1:80)抗體作用時(shí)間(60min)、底物最佳反應(yīng)時(shí)間(20min)、溫度(37℃)等對(duì)競(jìng)爭(zhēng)ELISA效果有重要影響的因素，建立檢測(cè)牛乳β-酪蛋白的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。經(jīng)敏感性實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明本實(shí)驗(yàn)建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法最低檢出量為5.1μg/mL，變異系數(shù)(CV)小于5%，可以開發(fā)應(yīng)用于牛乳及其制品的蛋白質(zhì)品質(zhì)快速檢測(cè)。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA；β-酪蛋白；雞卵黃抗體(IgY)

有效的檢測(cè)技術(shù)是保證乳品質(zhì)量安全的重要方面，目前的乳品摻假檢測(cè)技術(shù)主要針對(duì)摻假物一對(duì)一檢測(cè)[1-4]，主要有近紅外光譜法、高效液相色譜法、電泳法和免疫學(xué)方法等。光譜法、液相色譜法及電泳法具有準(zhǔn)確快速、重復(fù)性好、適用于定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但由于其設(shè)備造價(jià)高，操作繁瑣的原因，難以滿足基層及現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的要求。本實(shí)驗(yàn)以牛乳β-酪蛋白為目標(biāo)蛋白，建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法對(duì)牛乳固有酪蛋白進(jìn)行檢測(cè)，免疫檢測(cè)法具有特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單易行，尤其針對(duì)乳品中摻入其他雜蛋白的鑒別和原料奶酪蛋白質(zhì)量的快速檢測(cè)，在乳及乳制品質(zhì)量安全監(jiān)控方面有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雞卵黃抗體(anti-β-CN IgY，效價(jià)為1:2048)和酶標(biāo)牛乳β-酪蛋白抗原(β-CN-HRP，效價(jià)為1:320)分別參考文獻(xiàn)[5-7]制得；大豆蛋白粉(S)和明膠(G) 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛乳β-酪蛋白(β-CN)、牛乳β-乳球蛋白(β-Lg)、酶標(biāo)兔抗雞抗體IgG-HRP 美國(guó)Sigma公司。

ELISA采用辣根過氧化物顯色系統(tǒng)：1)包被緩沖液(CB)：0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液；2)洗滌液與稀釋液(PBST)：0.01mol/L pH7.4 PBS+0.5% Tween-20；3)封閉液(G)：含1%明膠的PBST；4)終止液：2mol/L H2SO4；5)底物溶液：2mL底物緩沖液(pH5.0磷酸檸檬酸緩沖液)+0.1mL TMB+6.4μL H2O2。

MK3型Thermo酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)板(96孔聚苯乙烯板) 北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗體的封閉

將抗體和牛乳β-乳球蛋白和大豆蛋白粉混合培養(yǎng)，封閉其中會(huì)和牛乳β-酪蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗體成分。

1.2.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA步驟

以合適質(zhì)量濃度的blocked anti-β-CN IgY包被酶標(biāo)板(每孔100μL，4℃過夜)，以封閉液(每孔300μL，4℃封閉過夜)封閉；同時(shí)加入等量酶標(biāo)抗原和抗原(系列濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)乳樣各50μL)，于水平軌跡搖床上室溫孵育2h，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。其中的洗板、顯色、測(cè)定操作同一般ELISA[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體 IgY的交叉反應(yīng)檢測(cè)與抗體修飾技術(shù)

雞卵黃抗體(anti-β-CN IgY)為多克隆抗體，是以標(biāo)準(zhǔn)牛乳β-酪蛋白作抗原免疫獲得雞卵黃，經(jīng)分離純化后得到的多克隆抗體。該多抗必須通過交叉反應(yīng)對(duì)抗體的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過抗體修飾技術(shù)[9-10]，將抗體和牛乳β-乳球蛋白和大豆蛋白粉混合，于37℃培養(yǎng)2h，封閉其中會(huì)和牛乳β-酪蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗體成分，可減少各批多克隆抗體間的變異程度，從而提高抗體的免疫反應(yīng)特異性。步驟如下：1)用PBST將抗體質(zhì)量濃度稀釋至1mg/mL；2)牛乳β-乳球蛋白(5mg/mL)和大豆蛋白粉(4mg/mL)等體積混合后，再與步驟1)所得液體等體積混合，37℃孵育2h后，4℃隔夜放置得到修飾的抗體(blocked anti-β-CN IgY)，質(zhì)量濃度為2.75mg/mL。

圖1 兩種抗體與4種蛋白抗原的交叉反應(yīng)Fig.1 Cross-actions of anti-β-CN IgY and blocked anti-β-CN IgY with four kinds of antigens

anti-β-CN IgY 和blocked anti-β-CN IgY 的交叉反應(yīng)[11-14]通過間接ELISA檢測(cè)，分別將4種蛋白質(zhì)抗原：β-酪蛋白(β-CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)、明膠(G)和大豆蛋白粉(S)以2n倍比稀釋后包被酶標(biāo)板，兩種抗體(質(zhì)量濃度調(diào)整至100μg/mL)與包被的蛋白質(zhì)抗原反應(yīng)，洗滌后加入酶標(biāo)兔抗雞抗體IgG-HRP(1:2000)，孵育后加入底物溶液顯色，檢測(cè)A450nm值，結(jié)果見圖1。

由圖1a可知，anti-β-CN IgY與β-酪蛋白、β-乳球蛋白、大豆蛋白粉、明膠(蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在12.5～1.6μg/mL范圍內(nèi)，除明膠外其他3種蛋白A450nm均大于0.2)免疫反應(yīng)后，A450nm值由大到小的順序?yàn)棣?酪蛋白＞β-乳球蛋白＞大豆蛋白粉＞明膠。anti-β-CN IgY對(duì)β-乳球蛋白的親和力與對(duì)其相應(yīng)蛋白質(zhì)抗原β-酪蛋白的親和力較為相近，對(duì)大豆蛋白粉的親和力稍弱，A450nm顯示存在一定交叉反應(yīng)，而與明膠(A450nm＜0.2)基本沒有交叉反應(yīng)。

由圖1b可知，通過所建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系用blocked anti-CN IgY多克隆抗體分別與β-酪蛋白(β-CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)、明膠(G)、大豆蛋白粉(S) (12.5μg/mL)進(jìn)行交叉反應(yīng)。結(jié)果表明blocked anti-β-CN IgY對(duì)β-酪蛋白的特異性明顯提高，對(duì)其他3種蛋白基本沒有交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA體系特異性良好，可以應(yīng)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)體系的建立[15-16]

2.2.1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA程序

通過方陣法，設(shè)定A450nm≈1.0，確定blocked antiβ-CN IgY(稀釋起始質(zhì)量濃度為1mg/mL)的包被最佳濃度為1:160；酶標(biāo)抗原最佳工作濃度β-CN-HRP為1:20。

2.2.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以最適抗體質(zhì)量濃度包被，加入酶標(biāo)抗原(最適工作濃度的2倍)和系列濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原(β-酪蛋白起始質(zhì)量濃度為400μg/mL，按2n稀釋)各50μL，搖床上室溫孵育2h，洗板4次后顯色測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)β-酪蛋白質(zhì)量濃度分別在6.25～400μg/mL時(shí)，IC50為348μg/mL，A450nm與β-酪蛋白的濃度呈良好的線性關(guān)系，可以用于β-酪蛋白在此質(zhì)量濃度區(qū)間的快速測(cè)定。

2.2.3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的指標(biāo)評(píng)價(jià)

2.2.3.1 敏感性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)已建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，向脫脂牛乳中摻入不同梯度的明膠，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件確定最低檢出量。所得數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定脫脂乳品敏感性實(shí)驗(yàn)平均值Table1 Sensibility assay of indirect-ELISA for skim milk

結(jié)果以P/N≤0.5判斷為陽(yáng)性。經(jīng)3組平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)混合樣品中牛乳成分的最低檢出量為3.5%即5.1μg/mL，接近國(guó)外采用哺乳動(dòng)物抗血清免疫方法檢出量[17-18]，有關(guān)其他摻假蛋白的研究還有待深入。

2.2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制5種不同質(zhì)量濃度的β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一質(zhì)量濃度平行測(cè)定5次，用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定吸光值，去除最大最小值，剩下3個(gè)值取平均，比較驗(yàn)檢結(jié)果的重復(fù)性，測(cè)量結(jié)果見表2。

表2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性Table2 Reproducibility assay of competitive-ELISA

從表2可以看出，板內(nèi)檢測(cè)陽(yáng)性抗原的A450nm值的變異系數(shù)(CV)小于5%，回收率91%～97%，說明所建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)β-CN抗原具有良好的重復(fù)性。

2.3 牛乳樣品的檢測(cè)

2.3.1 牛乳樣品制備及稀釋度的確定

將鮮牛乳和脫脂牛乳(3000r/min離心20min)分別以2n倍比稀釋(稀釋度1:10)后與最佳工作濃度下的酶標(biāo)抗原(β-CN-HRP)等體積混合，按100μL /孔加入已包被的酶標(biāo)孔進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鮮牛乳中的脂肪的存在對(duì)競(jìng)爭(zhēng)ELISA影響較大，當(dāng)牛乳的稀釋度從1:1增加到1:320時(shí)，A450nm值呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則變化，陰性對(duì)照值一直低于1，因此無(wú)法取值。而鮮牛乳經(jīng)過脫脂后進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，A450nm隨脫脂牛乳稀釋度的增加而增加，當(dāng)脫脂牛乳的稀釋度在1:80時(shí)陰性A450nm≈1.0，陽(yáng)性A450nm值小于0.4，且P/N值相對(duì)較小。因此選擇脫脂牛乳的競(jìng)爭(zhēng)稀釋度為1:80，或者可以不作稀釋。

2.3.2 牛乳樣品的測(cè)定

表3 乳品蛋白含量檢測(cè)結(jié)果Table3 Detection results of protein content in dairy products

由表3可知，以β-酪蛋白為檢測(cè)蛋白建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)得樣品中β-酪蛋白質(zhì)量濃度，并通過一般牛乳成分中總蛋白/β-酪蛋白的比例系數(shù)2.8572，計(jì)算得到理論總蛋白的質(zhì)量濃度，然后與通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的實(shí)際總蛋白質(zhì)量濃度相比較，相對(duì)誤差在－0.84%～0.1%范圍內(nèi)，CV小于5%。該結(jié)果反映了本實(shí)驗(yàn)所建立的ELISA體系測(cè)定牛乳蛋白質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確度和精密度都較高，可以實(shí)現(xiàn)ELISA檢測(cè)體系對(duì)牛乳質(zhì)量的定性定量監(jiān)測(cè)。錢博[19]研究發(fā)現(xiàn)采用考馬斯亮藍(lán)法與傳統(tǒng)的凱式定氮法測(cè)定乳中的真蛋白的結(jié)果沒有顯著性差異，因此本實(shí)驗(yàn)選用考馬斯亮藍(lán)法以酪蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定乳樣品的實(shí)際蛋白質(zhì)量濃度。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)確定抗體最佳包被質(zhì)量濃度，酶標(biāo)抗原最佳工作質(zhì)量濃度，封閉液及封閉時(shí)間，抗體稀釋液及酶標(biāo)抗原作用時(shí)間，底物最佳反應(yīng)時(shí)間等對(duì)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)有影響的因素，利用blocked anti-β-CN IgY抗體，初步建立了牛乳及其乳制品中固有蛋白成分的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。以脫脂牛乳的檢測(cè)程序?yàn)槔?，操作程序?jiǎn)單，整個(gè)檢測(cè)過程僅需4h(不計(jì)包被時(shí)間)，可同時(shí)處理多個(gè)不同牛乳樣品及重復(fù)實(shí)驗(yàn)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系的最大特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作作簡(jiǎn)單快速，能夠?qū)崿F(xiàn)牛乳及其乳制品的快速定量檢測(cè)，很有開發(fā)應(yīng)用潛力。

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Detection of Bovine β-Casein by Competitive ELISA

SONG Hong-xin，PAN Jie，BAI Hong-mei，XUE Hai-yan
(Institute of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

In order to establish a competitive ELISA method for detecting β-casein of bovine milk, the factors to affect competitive-ELISA were investigated. The optimal conditions for competitive ELISA method were coated anti-β-CN IgY concentration of 1:160, 1% gelatin-PBST as the blocking solution and blocking time of 1 h. The working titers betweenβ-CNHRP and detection samples were 1:20 and 1:80, respectively. The reaction time of antibody and antigen was 1 h and the optimum enzymatic reaction time was 20 min. Detection results indicated that the detected limit was 3.5% with a variation coefficient (CV) of less than 5%. This method can be used for rapid and accurate detection ofβ-casein in bovine milk and dairy products.

competitive ELISA；β-casein；egg-yolk antibody

Q512

A

1002-6630(2010)22-0450-03

2010-07-20

陜西省科學(xué)技術(shù)廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2009K02-09)；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目(09JC19)

宋宏新(1959—)，男，教授，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)、食品科學(xué)和免疫檢測(cè)研究。E-mail：hongxinsong@163.com