王求永，劉文革，王振宇

基礎(chǔ)研究

FTY720對大鼠急性脊髓損傷后RhoA表達的影響

王求永，劉文革，王振宇

目的觀察大鼠急性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后芬戈莫德（fingolimod，F(xiàn)TY720）對RhoA表達的影響，進一步探討FTY720治療SCI的可能機制。方法采用改良Allen’s法建立大鼠急性SCI模型。雌性SD大鼠75只，隨機分為假手術(shù)組（n=15）、損傷組（n=30）和FTY720組（n=30）。FTY720組傷后30 min一次性腹腔注射FTY720 0.5 mg/kg，假手術(shù)組和損傷組以相同方法給予濃度為0.9%的生理鹽水。分別于傷后1天、3天、7天、14天及21天，應(yīng)用RT-PCR和Western印跡法分別檢測RhoA mRNA和RhoA蛋白的表達。結(jié)果 損傷組RhoA mRNA和蛋白的表達于傷后3天開始明顯增加，7天達到高峰，21天仍維持高水平表達；在同一時間點，與FTY720組和假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。FTY720組傷后1天、3天和7天的RhoA表達高于假手術(shù)組（P＜0.05）。假手術(shù)組各時間點RhoA表達維持在較恒定水平。結(jié)論大鼠急性SCI后RhoA表達增加，F(xiàn)TY720可能通過抑制SCI后RhoA的表達，以達到減輕繼發(fā)性SCI、促進脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的目的。

脊髓損傷；免疫抑制劑；FTY720；RhoA；大鼠

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種高致殘性疾病。由于受傷機制的特殊性，對原發(fā)性SCI的干預(yù)措施相對較少，而針對繼發(fā)性SCI，預(yù)防或減少神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡和改善損傷局部的微環(huán)境成為當(dāng)前研究的熱點。20世紀(jì)80年代，Richardson等[1]發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后軸突很難再生，其主要原因并非由于軸突本身失去再生能力，而是因軸突周圍環(huán)境中存在抑制分子所致。髓磷脂相關(guān)抑制物如Nogo-A、MAG、Omgp等[2]已被證實是SCI后早期軸突再生失敗的主因，它們通過激活 RhoA及其下游的 Rho相關(guān)激酶（Rhoassociated kinase，ROCK）而最終導(dǎo)致生長錐的潰變，使神經(jīng)軸突再生受到抑制。因此有效抑制RhoA的激活成為目前治療SCI的一個新途徑。Lee等[3]的實驗研究表明，一種具有極強免疫抑制作用的神經(jīng)鞘氨醇類似物——芬戈莫德（fingolimod，F(xiàn)TY720）可促進大鼠脊髓損傷后的功能恢復(fù)。本實驗在大鼠急性SCI后早期腹腔注射FTY720，通過RT-PCR和Western印跡法檢測SCI后FTY720對RhoA表達水平的影響，進而探討FTY720可能的促進大鼠急性SCI修復(fù)的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雌性SD大鼠[SCXK(滬)2007000512669] 75只，體重（200±10）g，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑：FTY720（selleck，美國），Trizol試劑（Invitrogen），PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，日本），BCA法蛋白定量試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），RhoA及β-actin引物合成（上海生工生物公司），RhoA兔抗鼠多克隆一抗（Santa Cruz，美國）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司)。

1.2 SCI模型的制作和分組

75只大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，麻醉成功后將大鼠俯臥固定于動物手術(shù)臺上，常規(guī)消毒后在無菌條件下，以T10為中心取背部正中切口，手術(shù)切除T9～T11椎板，暴露脊髓，改良Allen法（Weight dropping，WD）制模。SCI動物模型隨機分為假手術(shù)組（A組）15只：只行椎板切除術(shù)，術(shù)后腹腔注射濃度為0.9%的生理鹽水；損傷組（B組）30只：SCI后腹腔注射相同濃度的生理鹽水；FTY720組（C組）30只：SCI后腹腔注射FTY720 0.5 mg/kg。術(shù)后每天早晚2次膀胱擠壓排尿，直至建立反射性膀胱排空。

1.3 取材及切片制備

分別于術(shù)后1天、3天、7天、14天、21天切取大鼠脊髓組織，以損傷節(jié)段為中心約15 mm，由損傷正中處橫斷面用鋒利刀片將其一分為二（分別用于行RT-PCR和Western blot法檢測），立即置于液氮中，-80℃保存待測，每個時間點A組每次3只，B組和C組每次各6只。

1.4 RT-PCR法檢測RhoAmRNA表達水平

Trizol試劑法提取大鼠脊髓組織總RNA，按PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作，以逆轉(zhuǎn)錄法先合成第一鏈cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。RhoA mRNA引物序列：正義鏈，5’-TAGAGTTGGCTTTATGGGA CAC-3’，反義鏈，5’-GCTTCACAAGATGAGGC ACC-3’；預(yù)擴增引物長度為428 bp；以β-actin作內(nèi)參照，引物序列：正義鏈，5’-CACGATGGAGGG GCCGGACTCATC-3’，反義鏈，5’-TAAAGAC CTCTATGCCAACACAGT-3’；預(yù)擴增引物長度為240 bp。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳后進行凝膠成像系統(tǒng)分析處理，以RhoA與β-actin的灰度比值表示相對RhoAmRNA水平。

1.5 Western blot法檢測RhoA蛋白表達水平

樣品勻漿后采用BCA法測定總蛋白濃度。取80 μL樣品和20 μL 5×樣品處理液，混合均勻，沸水中煮沸10 min，然后上樣，每孔上樣量20 μL；電泳條件：5%濃縮膠恒壓90 V，約20 min；10%分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。全濕式電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，將膜浸沒在TBST溶解的5%脫脂奶粉中，37℃振蕩封閉1 h，依次加入RhoA兔抗鼠多克隆一抗（1∶200）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶5 000）進行結(jié)合反應(yīng)；ECL增強化學(xué)發(fā)光顯色、壓片、曝光、顯影、沖洗膠片。以β-actin為內(nèi)參照，求RhoA與β-actin的灰度比值表示相對RhoA蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RhoAmRNA表達水平

見圖1、表1。瓊脂糖凝膠電泳目的基因產(chǎn)物符合設(shè)計大小，表明擴增產(chǎn)物是目的基因。A、B、C 3組在各時間點均有RhoA mRNA表達，與A、C組比較，B組RhoA mRNA表達水平于脊髓損傷1天后增高，3天后顯著升高，1周時達高峰，2周時持續(xù)高表達，3周時略有下降，各時間點與A、C組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；2、3周時A組與C組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 不同時間點各組RhoAmRNA表達變化

圖2 不同時間點各組RhoA蛋白表達變化

表1 不同時間點各組RhoAmRNA的相對表達水平

表2 不同時間點各組RhoA蛋白的相對表達水平

2.2 RhoA蛋白表達水平

見圖2、表2。A組RhoA蛋白表達水平隨時間推移并無明顯變化，而B組RhoA蛋白表達水平于術(shù)后3天明顯增高，1周達高峰，2周、3周時仍有高表達，但較前有所下降；B組各時間點RhoA蛋白表達水平顯著高于A組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；2、3周時A組與C組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

急性SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，SCI后軸突再生抑制是繼發(fā)性損傷的重要組成部分，導(dǎo)致軸突難以再生的一個重要原因是損傷局部環(huán)境中存在一些軸突生長抑制因子，主要為髓磷脂相關(guān)抑制物如Nogo-A、MAG、Omgp等。這些因子雖然結(jié)構(gòu)不同，但通過與相同的受體NgR共同介導(dǎo)，在p75的參與下，對細(xì)胞內(nèi)RhoA信號通路產(chǎn)生影響[4-6]，最終導(dǎo)致生長錐的潰變，使軸突的生長受到抑制。Sung、吳濱奇等[7-8]的一系列實驗研究表明，抑制RhoA信號通路對于促進SCI后軸突再生以及損傷后的功能恢復(fù)是一個可行的方法。

FTY720是近年來研究發(fā)現(xiàn)的將冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-Ⅰ進行結(jié)構(gòu)改造而合成的一種新型免疫抑制劑[9]。與傳統(tǒng)免疫抑制劑不同，F(xiàn)TY720的作用機制與淋巴細(xì)胞激活信號無關(guān)，而是以影響淋巴細(xì)胞定居和遷徙為主。S1P是鞘磷脂分解的一種產(chǎn)物，與其相結(jié)合的是5種G蛋白偶聯(lián)受體，即S1P1～S1P5受體。這些受體在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種生理功能，其中S1P1受體在對淋巴細(xì)胞功能的調(diào)控方面起主要作用。FTY720在體內(nèi)被鞘氨醇激酶2（Sph-ingosine kinase 2，SphK2）磷酸化為具有生物活性的(S)-FTY720-P異構(gòu)體。(S)-FTY720-P與5種1-磷酸鞘氨醇受體中的S1P1、S1P4和S1P5受體之間具有高親合力，與S1P3受體之間親合力較低，與S1P2受體則不結(jié)合。磷酸化后的FTY720成為S1P的類似物，通過作用于S1P而抑制淋巴細(xì)胞外流，使S1P1受體下調(diào)，從而建立起一個暫時性的由藥物引起的淋巴細(xì)胞S1P1受體缺失狀態(tài)，進而限制淋巴細(xì)胞從胸腺和外周淋巴組織游出，導(dǎo)致外周淋巴細(xì)胞減少[10]。實驗研究證實，F(xiàn)TY720作用于機體所造成的外周淋巴細(xì)胞減少是其免疫抑制的主要途徑[11]。FTY720在器官移植的動物實驗和臨床Ⅲ期實驗中均顯示其強大的免疫抑制活性和獨特的藥理作用，且與常規(guī)免疫抑制劑有協(xié)同效應(yīng)，毒副作用小[12]。近年來更有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720對SCI具有明顯的治療作用。Lee等[3]利用FTY720治療SCI的實驗研究表明，F(xiàn)TY720能夠明顯減輕SCI部位炎癥反應(yīng)，并促進SCI后后肢功能和排尿功能的恢復(fù)。孫思鑫等[13]應(yīng)用FTY720和他克莫司對大鼠SCI進行治療的實驗結(jié)果證實，SCI早期應(yīng)用FTY720和FK506治療均有顯著療效，兩者相比又以FTY720效果更優(yōu)；Zhang等[14]進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720和FK506在大鼠SCI治療中具有協(xié)同作用，其療效比單用FTY720或FK506更明顯。Miron等[15]的體外研究表明，F(xiàn)TY720通過調(diào)節(jié)S1P受體mRNA水平促進成人人體成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活；實驗觀察結(jié)果顯示，其對多發(fā)性硬化癥和因髓鞘完整性受到破壞的SCI均有治療作用。目前FTY720治療SCI的作用機制尚不明確，研究者們推測在SCI動物模型中，F(xiàn)TY720可能通過誘導(dǎo)S1P1相關(guān)受體長時間內(nèi)化而導(dǎo)致外周淋巴細(xì)胞減少，這就使得浸潤到SCI部位的淋巴細(xì)胞明顯減少，從而達到抑制損傷部位炎癥反應(yīng)、促進SCI修復(fù)的目的。

本實驗通過RT-PCR和Western印跡法檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠急性SCI后FTY720組RhoA表達在基因和蛋白水平較損傷組顯著降低，推測FTY720可能通過抑制SCI后RhoA的表達來發(fā)揮作用。RhoA是小G蛋白超家族中Rho家族的Rho亞族中的成員。Rho蛋白以兩種形式存在：GDP結(jié)合形式（GDP-Rho，非活化形式）和GTP結(jié)合形式（GTP-Rho，活化形式）。雖然RhoA作用有多個靶目標(biāo)，但主要是ROCK（即Rho激酶），屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是RhoA下游最主要的也是最具特色的信號分子[16]。RhoA激活后，有活性的RhoGTP刺激下游的ROCK。RhoA與ROCK結(jié)合，取代ROCK的C末端自我抑制區(qū)，激活其催化區(qū)，使其活化，并進一步使肌球蛋白（myosin light chain，MLC）和MLC磷酸酶磷酸化，抑制MLC磷酸酶活性，使MLC活化，促進應(yīng)力纖維形成，調(diào)節(jié)actin-myosin-Ⅱ的收縮力，從而影響肌動-球蛋白系統(tǒng)而導(dǎo)致生長錐塌陷。ROCK也可以通過作用于LIM激酶而發(fā)揮以上作用[17]。Zhou等[18]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720可通過使RhoA-GTPase失活而抑制非雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力。因此，F(xiàn)TY720有可能通過使RhoA-GTPase失活，抑制RhoA的激活，阻斷RhoA信號通路的方式來促進SCI后的軸突再生，從而對損傷后功能的恢復(fù)起到促進作用。

綜上所述，在脊髓損傷中，RhoA的活性表達可引起一系列反應(yīng)，最終影響肌動-球蛋白系統(tǒng)而導(dǎo)致生長錐塌陷，神經(jīng)軸突再生抑制。FTY720可能通過抑制大鼠脊髓損傷后RhoA的激活來改善損傷局部微環(huán)境，促進脊髓損傷神經(jīng)再生和運動功能的恢復(fù)。FTY720是第一個S1P受體激動劑類新藥，具有功能強大、作用可逆、給藥方便、毒副作用小、治療窗寬、不影響全身免疫功能等優(yōu)點，且與環(huán)孢素A等傳統(tǒng)免疫抑制劑具有協(xié)同效用，可望為治療SCI提供新的途徑。誠然，在臨床應(yīng)用之前，尚需大量實驗對該藥的適用性、有效性和安全性展開進一步的探索和研究。

[1]Richardson PM,McGuinness UM,Aguayo AJ.Axons from CNS neurons regenerate into PNS grafts[J].Nature,1980, 284(5753):264-265.

[2]Woolf CJ,Bloechlinger S.Neuroscience:it takes more than two to Nogo[J].Science,2002,297(5584):1132-1134.

[3]Lee KD,Chow WN,Sato-Bigbee C,et al.FTY720 reduces inflammation and promotes functional recovery after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2009,26(12):2335-2344.

[4]Hasegawa Y,Fujitani M,Hata K,et al.Promotion of axon regeneration by myelin-associated glycoprotein and Nogo through divergentsignals downstream of Gi/G [J].J Neurosci,2004,24(30):6826-6832.

[5]Mackay DJ,Hall A.Rho GTPases[J].J Biol Chem,1998,273 (33):20685-20688.

[6]Zhou C,Li Y,Nanda A,et al.HBO suppresses Nogo-A, Ng-R,or RhoA expression in the cerebral cortex after global ischemia[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,309(2): 368-376.

[7]Sung JK,Miao L,Calvert JW,et al.A possible role of RhoA/ Rho-kinase in experimental spinal cord injury in rat[J].Brain Res,2003,959(1):29-38.

[8]吳濱奇,畢鄭鋼,Binqi W,等.阻斷Rho/ROCK信號傳導(dǎo)通路治療大鼠脊髓損傷的實驗研究[J].中國骨與關(guān)節(jié)外科, 2008,1(4):307-311.

[9] KiuchiM,AdachiK,Kohara T,etal.Synthesisand immunosuppressive activity of 2-substituted 2-aminopropane-1,3-diols and 2-aminoethanols[J].J Med Chem,2000,43 (15):2946-2961.

[10]Matloubian M,Lo CG,Cinamon G,et al.Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1[J].Nature,2004,427(6972):355-360.

[11]Chiba K,Matsuyuki H,Maeda Y,et al.Role of sphingosine 1-phosphate receptor type 1 in lymphocyte egress from secondary lymphoid tissues and thymus [J].CellMol Immunol,2006,3(1):11-19.

[12]鐘帆,陸曉和,彭小娟.新型免疫抑制劑FTY720的研究進展[J].廣東醫(yī)學(xué),2007,28(2):319-321.

[13]孫思鑫,曹曉建,汪雷,等.FTY720與他克莫司對脊髓損傷有顯著療效[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版,2008,28(1): 20-23,36.

[14]Zhang J,Zhang A,Sun Y,et al.Treatment with immunosuppressantsFTY720 and tacrolimus promotes functional recovery after spinal cord injury in rats[J].Tohoku J Exp Med,2009,219(4):295-302.

[15]Miron VE,Hall JA,Kennedy TE,et al.Cyclical and dose-dependent responses of adult human mature oligodendrocytes to fingolimod[J].Am J Pathol,2008,173 (4):1143-1152.

[16]Loirand G,Guerin P,Pacaud P.Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology[J].Circ Res,2006,98(3): 322-334.

[17]Fournier AE,Takizawa BT,Strittmatter SM.Rho kinase inhibition enhances axonal regeneration in the injured CNS [J].J Neurosci,2003,23(4):1416-1423.

[18]Zhou C,Ling MT,Kin-Wah-Lee T,et al.FTY720,a fungus metabolite,inhibits invasion ability of androgen-independent prostate cancer cells through inactivation of RhoA-GTPase [J].Cancer Lett,2006,233(1):36-47.

Effect of FTY720 on RhoA expression after acute spinal cord injury in rats

WANG Qiu-yong,LIU Wen-ge,WANG Zhen-yu.Department of Orthopaedics,Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Fuzhou, Fujian 350001,China

LIU Wen-ge,E-mail:wenge1999@yahoo.com.cn

Objective To investigate the effect of fingolimod(FTY720)on RhoA expression after spinal cord injury(SCI)in rats,and explore the possible mechanism of FTY720 in the treament of SCI.Methods A rat model of acute SCI was established with a modified Allen's method.Seventy-five female Sprague-Dawley(SD) rats were divided randomly into three groups:the sham-operation group(n=15),the injury group(n=30)and the group treated with FTY720(n=30).The FTY720 group

intraperitoneal injections of FTY720 0.5 mg/kg at 30 minutes after SCI,and the sham-operation group and the injury group received 0.9%normal saline in the same way.The expression of RhoA mRNA and protein were detected respectively by RT-PCR and western blotting technique at 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d after SCI.Results The expression of RhoA mRNA and protein in the injury group rose markedly at 3 d,reached a peak at 7 d and still maintained high level at 21 d after injury.The results of the injury group compared to those of the FTY720 and sham-operation groups were statistically different at the same time point(P＜0.05).In addition,the expression of RhoA in the FTY720 group at 1 d,3 d and 7 d were higher than those in sham-operation group(P＜0.05)which kept a constant level throughout the experiment.Conclusion The expression of RhoA increases after acute SCI in rats.FTY720 may attenuate secondary SCI and improve the recovery of neurological function in rats by prohibiting the expression of RhoA after acute SCI.

Spinal cord injuries;Immunosuppressive agents;FTY720;RhoA;Rats

R651.21，R979.5

A

1674-666X(2010)04-0292-05

2010-10-30；

2010-11-28）

（本文編輯 陳 娜）

10.3969/j.issn.1674-666X.2010.04.010

350001福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院骨科

劉文革，E-mail：wenge1999@yahoo.com.cn