楊 哲綜述,張 勇審校

（濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心外科 250000）

心臟是脊椎動(dòng)物在胚胎發(fā)育過程中第一個(gè)形成的器官,脊椎動(dòng)物的心臟由多細(xì)胞系的特化到管狀結(jié)構(gòu)的形成,最后精確組裝為成熟的4個(gè)心腔結(jié)構(gòu),經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過程,它涉及到多種基因不同時(shí)間和不同空間的先后表達(dá)與相互作用。研究脊椎動(dòng)物心肌基因表達(dá)的分子調(diào)控是了解調(diào)節(jié)心肌發(fā)生的關(guān)鍵。Nkx2-5是目前研究較多的與心臟發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

1 Nkx2-5轉(zhuǎn)錄因子

最初人們應(yīng)用果蠅同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain,HD）寡核苷酸探針篩查果蠅cDNA文庫,克隆出NK型同源盒基因,隨后分離出一種與果蠅背側(cè)血管/心臟發(fā)育密切相關(guān)的果蠅NK-2型基因——tinman基因。當(dāng)tinman基因發(fā)生突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致果蠅心臟形成異常。由于該類基因在進(jìn)化中的高度保守性,人們猜測是否在脊椎動(dòng)物體內(nèi)也存在著這一類基因并且保留著相似的功能。目前已從脊椎動(dòng)物鑒定出6個(gè)結(jié)構(gòu)和功能上與tinman基因相關(guān)的基因,即Nkx2-3、Nkx2-5、Nkx2-6、Nkx2-7、Nkx2-8、Nkx2-9。其中Nkx2-5/Csx（cardiac specific homebox）基因正是影響心臟發(fā)育的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子之一[1]。1993年研究人員應(yīng)用cDNA文庫篩查、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、RT-PCR和原位雜交等分子技術(shù)分別在兩棲類和嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)分離出Nkx2-5基因,并證明其確實(shí)與果蠅tinman基因高度同源[2]。Lyons等[3]報(bào)道被破壞Nkx2-5基因的小鼠心臟發(fā)育異常。Turbay等[4]在成人心臟cDNA文庫中分離出Nkx2-5基因,進(jìn)一步將其定位于5q35。Schott等[5]證實(shí)在人類先天性心臟病患者中確實(shí)存在 Nkx2-5基因的突變。

NK-2編碼轉(zhuǎn)錄激活因子是DNA結(jié)合蛋白質(zhì),結(jié)合位點(diǎn)位于目的基因的啟動(dòng)子和（或）增強(qiáng)子的共有序列（T[C/T]AAGTG）,它能激活轉(zhuǎn)錄。它的同源結(jié)構(gòu)域（60個(gè)氨基酸）的三維結(jié)構(gòu)是由3個(gè)α-螺旋組成,其中螺旋Ⅱ和Ⅲ形成一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu),NK-2同源結(jié)構(gòu)域的C-末端包含17個(gè)氨基酸的保守序列,NK-2特異結(jié)構(gòu)域有一個(gè)不變的疏水氨基酸中心簇（VPVLV）,它可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互影響中起作用,如果這個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變,將會(huì)影響它在體外結(jié)合DNA的能力。Nkx2-5是NK型同源盒基因家族Nkx2型成員,是心臟前體細(xì)胞分化的最早期標(biāo)志之一。它主要通過同源盒結(jié)構(gòu)域與目的基因中相應(yīng)的順式作用元件（NKE）序列（5′-TNAAGTG-3′）結(jié)合,作為轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄,在胚胎發(fā)育和器官形成中發(fā)揮重要作用。Nkx2-5位于人類染色體5q35,具有兩個(gè)外顯子。該基因的側(cè)翼序列及外顯子之間存在著許多具有重要功能的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、抑制因子和一些自動(dòng)調(diào)節(jié)因子。它們?cè)诓煌瑫r(shí)間和空間調(diào)控Nkx2-5基因,使其在心臟及其他器官的發(fā)育過程中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。Nkx2-5基因編碼的蛋白具有4類高度保守的結(jié)構(gòu)域,其中包括N端的TN（tin）結(jié)構(gòu)域、160個(gè)氨基酸組成的同源盒結(jié)構(gòu)域（HD）、位于HD下游的NK2-SD和C端含有GI-RAW保守的結(jié)構(gòu)域。其中HD可以與目的基因中相應(yīng)的啟動(dòng)子結(jié)合,從而促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)這種蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合的最有意義的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸等,除此之外Nkx2-5還有一個(gè)富含丙氨酸和脯氨酸殘基的阻遏結(jié)構(gòu)域,以及富含上述兩種氨基酸和天冬氨酸、谷氨酸殘基的激活域。它們的變化將引起蛋白質(zhì)-DNA間親合力的改變,從而影響基因的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生相關(guān)蛋白的缺陷,形成心臟畸形[6]。

Nkx2-5基因具有明顯的心臟特異性表達(dá)的特點(diǎn),雖然在發(fā)育階段的脾、舌、胃和甲狀腺等組織中Nkx2-5基因也有低度表達(dá),但出生后除心臟外其他器官中Nkx2-5蛋白水平都明顯下降。這說明Nkx2-5在mRNA和蛋白水平上對(duì)多種器官的發(fā)育都有一定的影響,尤其對(duì)心臟發(fā)育的作用最為明顯[7]。

Nkx2-5是背側(cè)中胚層形成所必需的,它在心肌開始分化前即開始表達(dá),是所有脊椎動(dòng)物心臟發(fā)生中最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,即心臟前體細(xì)胞最早的標(biāo)志物。在心臟發(fā)育過程中，Nkx2-5最初見于心臟頭褶期心肌源性前體細(xì)胞,持續(xù)表達(dá)于心肌細(xì)胞分化階段,隨后在胚胎、胎兒和成體心肌細(xì)胞中保持一定的表達(dá)水平。應(yīng)用 RNA原位標(biāo)記技術(shù)顯示在懷孕后7.5d時(shí)Nkx2-5開始表達(dá),主要在心肌發(fā)生板的內(nèi)胚層和中胚層的細(xì)胞核中表達(dá)[8]。到了成熟階段,Nkx2-5/Csx只在房室肌細(xì)胞核中表達(dá)。Nkx2-5/Csx基因突變的純合子小鼠胚胎可形成心臟,但不能正常旋轉(zhuǎn),且心壁變薄、心功能不全、心臟不完全分隔、不表達(dá)心室特異性基因等,胚胎很快死于循環(huán)衰竭[7]。

隨著對(duì)Nkx2-5基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)情況的闡明,更多的研究轉(zhuǎn)向Nkx2-5基因的功能及調(diào)節(jié)作用機(jī)制。大量研究表明，Nkx2-5基因敲除導(dǎo)致胚胎死于心臟畸形,Nkx2-5基因的過度表達(dá)也可以引起心臟增大。有資料顯示,Nkx2-5基因位于許多對(duì)心臟發(fā)育有作用的基因的上游,在Nkx2-5-/-小鼠應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)anf、mlc2v、mef2c、mhc等基因的表達(dá)受到嚴(yán)重干擾[9]。同時(shí),Nkx2-5基因也受到多種因素的調(diào)節(jié)。脊椎動(dòng)物與果蠅dpp基因相關(guān)的基因骨形成蛋白（bone morphogenesis proteins,BM Ps）在胚胎中胚層的形成早期發(fā)揮作用,小鼠bmp2缺失,Nkx2-5不表達(dá),心臟早期發(fā)育階段停滯[10]。有研究表明,GATA-4和Nkx2-5之間存在相互協(xié)調(diào)作用,并具有啟動(dòng)子依賴性,而且復(fù)雜的順式調(diào)節(jié)作用在心肌細(xì)胞的基因表達(dá)中有重要地位。體外實(shí)驗(yàn)表明,Nkx2-5基因的表達(dá)可以啟動(dòng)心肌的發(fā)生,并且在心肌分化過程中激活mef2c基因；而mef2c基因的表達(dá)在啟動(dòng)心肌發(fā)生的同時(shí)可以上調(diào)Nkx2-5、GATA4、α-肌動(dòng)蛋白和M HC的表達(dá)[11]。

2 Nkx2-5與其他轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用

有研究表明,GATA-4與Nkx2-5能相互作用,彼此是輔助因子。在心肌細(xì)胞中兩者相互作用調(diào)節(jié)心房利鈉因子和α-心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因分析顯示,ANF啟動(dòng)子有1個(gè)Nkx2-5的結(jié)合位點(diǎn),2個(gè)GATA-4結(jié)合位點(diǎn),這些結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于ANF的表達(dá)是必須的[12]。有研究表明,Nkx2-5和GATA-4轉(zhuǎn)錄因子可以通過協(xié)同作用使內(nèi)源性α-心肌肌動(dòng)蛋白 mRNA表達(dá)增高 100倍[13]。它們的交互作用是通過Nkx2-5的同源區(qū)域的螺旋Ⅲ和GATA-4的C-終端鋅指區(qū)域之間的相互作用實(shí)現(xiàn)的。在異源細(xì)胞中共同表達(dá)GATA-4和Nkx2-5導(dǎo)致協(xié)同激動(dòng)ANF的啟動(dòng)子。這個(gè)協(xié)同作用包括在離體和在體上的GATA-4和Nkx2-5相互作用。結(jié)構(gòu)/功能分析說明GATA-4結(jié)合到Nkx2-5可以導(dǎo)致Nkx2-5激動(dòng)區(qū)域的結(jié)構(gòu)改變,這種作用可以在早期心肌形成關(guān)鍵路徑中提供協(xié)同的交叉作用[14]。

GATA-4因子也能調(diào)節(jié)Nkx2-5在心肌發(fā)育時(shí)的表達(dá),提示在心肌中Nkx2-5和GATA轉(zhuǎn)錄因子之間存在一個(gè)相互增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)循環(huán)通路。在早期心臟形成中,GATA-4在心臟譜系與Nkx2-5共表達(dá),GATA-4和Nkx2-5互相依賴共同發(fā)揮作用,在Nkx2-5的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子含有限制性心臟鋅指轉(zhuǎn)錄因子GA TA-4的高親和性結(jié)合位點(diǎn),Nkx2-5的心臟特異性上游增強(qiáng)子在線性心管和環(huán)化的過程中處于活化狀態(tài)[15]。

綜上所述,組織特異性Nkx2-5同源核蛋白是心肌細(xì)胞前體最早的標(biāo)記,是心臟形成的關(guān)鍵,但不能發(fā)起心臟的形成。它在心臟發(fā)育過程中與其他的轉(zhuǎn)錄因子起著互相協(xié)同的作用,一起調(diào)節(jié)心肌特異基因的表達(dá)。過度表達(dá)Nkx2-5可以促進(jìn)前體心肌細(xì)胞的發(fā)育。

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