陳 姣,鐘 凌綜述,賈永前審校

(1.四川大學華西醫(yī)院血液科,成都610041;2.四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院檢驗科,成都610072)

Hepcidin是一種由肝臟細胞產(chǎn)生的具有廣譜殺菌抑菌作用的抗菌肽,屬于防御性蛋白家族。它有3種形式,分別由20、22、25個氨基酸組成,其中以25個氨基酸為其主要形式和主要活性部分,稱作Hepcidin-25。有研究表明,Hepcidin是鐵代謝的關鍵調(diào)節(jié)因子,積極參與貧血、組織缺氧和炎癥反應,與腎病發(fā)生發(fā)展及預后有著密切的關系[1]。現(xiàn)將Hepcidin與腎病的關系綜述如下。

1 Hepcidin的結構

Hepcidin是一種富含半胱氨酸的小分子肽,為炎癥急性期反應蛋白。2000年Krause等[2]首先從人類血漿的超濾液中分離出一種小分子肽,命名為肝臟表達的抗微生物多肽(1iverexpressed antimi-crobial peptide,LEAP-1)。2001年Park等[3]從人類的尿液中分離出同一種多肽,并命名為 Hepcidin。Hepcidin在肝臟特異表達,而在其他器官,如心臟、脊髓、肺表達很少[4]。Hepcidin在肝臟合成,首先產(chǎn)生一種早期多肽,由84個氨基酸殘基組成[5]。在其Gly24和Ser25之間存在一個酶切位點,當酶切去除其24個氨基酸殘基的信號肽后,形成由60個氨基酸殘基組成的前體肽(pro-Hepcidin),并通過轉(zhuǎn)運進入血液循環(huán),最后由前肽轉(zhuǎn)化酶(propeptide convertase)在N端的不同位點剪接生成3種不同的成熟小肽(Hepcidin20、22、25)。它們相對分子質(zhì)量分別為2 192、2 436、2 789 D。由于富含堿性氨基酸殘基,在正常pH值情況下它們帶有3+電荷。20、25個氨基酸多肽是Hepcidin的主要存在形式。Hepcidin-20通常以單體形式存在于溶液中,而Hepcidin-25則是以多聚體的形式存在,這一性質(zhì)說明這兩種小分子肽有著不同的生物活性,Hepcidin-25為Hepcidin主要的活性形式[6]。而其前體無生物學活性,在剪接成Hepcidin-25后才能參與至鐵代謝中[7]。編碼Hepcidin基因定位于19號染色體上,它由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,其中第3個外顯子編碼了Hepcidin的氨基酸序列。Hepcidin基因序列和結構及其蛋白結構在物種間高度保守。Hunter等[5]利用核磁共振光譜測定法分析Hepcidin的結構,發(fā)現(xiàn)Hepcidin是一個發(fā)夾狀結構,其2個臂由4個分子內(nèi)二硫鍵連接形成一個梯樣構型。Hepcidin蛋白結構上具有重要意義的特點就在于其結構中第4、5個半胱氨酸殘基在發(fā)夾結構的拐角處形成了一個二硫鍵,使局部呈現(xiàn)出一個扭曲的β轉(zhuǎn)角結構。這種二硫鍵與通常情況下其他二硫鍵相比,具有更高的化學反應活性,其代表一類新的抗生物多肽。

2 Hepcidin與鐵代謝

鐵元素是機體諸多代謝途徑所不可缺少的。鐵參與血紅蛋白形成,調(diào)節(jié)免疫受體機制,其在線粒體呼吸和DNA合成中的作用直接影響腫瘤細胞的增殖。缺鐵可導致貧血和生長缺陷;鐵過量則會導致器官損傷。人體內(nèi)存在著嚴格的鐵代謝機制調(diào)節(jié),保持機體鐵穩(wěn)態(tài)(iron homeostaisis)。

Hepcidin是維持鐵穩(wěn)態(tài)極其重要的負激素,參與對貧血、組織缺氧及炎癥的機體反應,并被認為具有抑制小腸對鐵的吸收和胎盤對鐵的轉(zhuǎn)運以及促進鐵在網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中滯留的作用。其靶分子是分布在腸黏膜上皮細胞、單核巨噬細胞表面的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白Ferroportin(Fp1)。Fp1是目前惟一已知的細胞鐵輸出者,是一種跨膜蛋白,并且在所有組織細胞膜表達,掌控肝細胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮、巨噬細胞及十二指腸細胞中大部分鐵的流動。其通過控制小腸鐵吸收達到調(diào)節(jié)機體鐵穩(wěn)態(tài)[8]。機體鐵水平調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)在Hepcidin與Fp1的相互作用上[9]。Hepcidin通過與Fp1的直接作用,調(diào)控Fp1的表達量而控制鐵吸收、循環(huán)、再利用等。當鐵負荷增加時,誘導肝臟 Hepcidin表達增加,當Fp1與Hepcidin結合后,Fp1酪氨酸殘基會在質(zhì)膜上發(fā)生短暫的磷酸化,二者突變后會阻止Hepcidin所介導的Fp1的內(nèi)化。一旦發(fā)生內(nèi)化,Fp1會因去磷酸化而出現(xiàn)泛素化。泛素化的 Fp1以小囊泡的形式運輸最終在溶酶體降解[10],從而使鐵的轉(zhuǎn)出受到阻斷,從而使腸細胞鐵輸出量降低,鐵在細胞內(nèi)積累,由此導致鐵的吸收以及肝細胞和巨噬細胞內(nèi)儲存鐵的動員減少,進入血漿中的鐵含量降低,可利用鐵下降。相反,鐵缺乏時,Hepcidin表達受抑,而Fp1的表達不變,以允許大部分鐵通過Fp1流出來維持細胞外正常的鐵濃度[11]。研究證實,Hepcidin基因一旦被敲除,血清中Hepcidin過低,鐵吸收過多,小鼠即可出現(xiàn)血清鐵蛋白明顯上升、鐵在肝臟中異常沉積[12]?？傊?鐵負荷抑制 Hepcidin的表達,而其他如貧血、缺氧、炎癥則可促進其表達[13]。

在發(fā)生免疫反應時,炎癥因子,如IL-6有強烈的誘導作用[14],其作用于肝臟細胞,使 Hepcidin mRNA合成增多而肝臟和小腸Fp1表達量下降。Hepcidin通過血液到達小腸,與Fp1結合并內(nèi)化降解,抑制了小腸鐵的吸收。在肝臟和巨噬細胞中Hepcidin也發(fā)揮同樣的作用,抑制細胞中的鐵釋放。于是,血清鐵減少,轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度下降,機體可利用的鐵減少,對抑制炎癥發(fā)展起到積極作用。研究表明,當外源性Hepcidin注入小鼠體內(nèi)時,十二指腸黏膜對鐵的吸收和轉(zhuǎn)運會明顯降低,而鐵向血循環(huán)轉(zhuǎn)運的比例則不受影響,進一步證實Hepcidin是影響腸道鐵吸收的關鍵因素[15]。Nicolas等[16]也發(fā)現(xiàn)Hepcidin基因過度表達會造成轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)鐵離子缺乏的特殊表型,而肝臟缺乏Hepcidin基因表達的小鼠形成了嚴重的組織鐵超負荷。因此Hepcidin是維持鐵穩(wěn)態(tài)的關鍵因素。

3 Hepcidin與腎臟疾病

眾多研究表明,在腎臟疾病中,鐵代謝、貧血、炎癥均與腎臟疾病的發(fā)生有密切的關系。Hepcidin不僅作為調(diào)節(jié)鐵代謝的重要因素,維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的平衡,而且還參與炎癥反應,抑制某些細菌和真菌生長繁殖,同時炎癥、貧血等很多反應都會對Hepcidin的表達產(chǎn)生影響。所以,Hepcidin對研究腎臟疾病具有十分重要的臨床意義。

3.1 Hepcidin與腎性貧血 貧血一直被認為是慢性腎功能衰竭(CRF)的標志之一,可以引起CRF患者死亡率升高。CRF時,腎臟貧血的主要原因為腎臟促紅細胞生成素(Erythropoietin或EPO)產(chǎn)生相對不足或不能分泌。由于EPO主要是由腎小管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生,在紅系發(fā)生過程中起重要作用。EPO是治療腎性疾患引起的貧血的主選藥物。絕大部分CRF患者應用EPO治療可以獲得滿意療效,但仍有約5%～10%尿毒癥患者應用EPO常規(guī)治療劑量治療后療效不佳。對EPO治療反應低被稱之為“EPO抵抗”。其最常見的原因是鐵缺乏。其中包括了鐵的絕對不足以及功能性鐵缺乏。功能性鐵缺乏是指體內(nèi)鐵儲備充分,而鐵不能被充分利用。而Hepcidin是調(diào)節(jié)機體鐵的吸收和儲存以維持鐵穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)。目前研究證實其在終末期腎病中明顯升高,與鐵代謝的改變和終末期腎病引起的貧血有關[17]。吳曉亮和戴世學[18]采用腺嘌呤建立腎性貧血大鼠模型,并依據(jù)析因設計方差分析進行實驗分組和數(shù)據(jù)處理,以評估治療前后腎性貧血大鼠紅細胞數(shù)目、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細胞的變化,結果發(fā)現(xiàn),注射人重組EPO(rHuEPO)后,肝臟、脾、骨髓非血紅素鐵的含量明顯下降,說明肝臟及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)儲鐵量降低,將貯存鐵釋放以用于血紅蛋白的合成,從而使機體處于低鐵狀態(tài)。當紅細胞生成活躍需要增加鐵供應時,Hepcidin受抑,以配合紅細胞生成的要求。但是Hepcidin-25對rHuEPO促進腎性貧血大鼠的Ret生成起抑制作用,提示注射Hepcidin衍生物可能抑制 EPO對大鼠腎性貧血的治療作用。Hepcidin可能是引起EPO抵抗的原因之一。

Ashby等[19]研究Hepcidin與腎臟疾病關系時提出:(1)Hepcidin的一般晝夜變化在鐵供應降低的人群中是減少的,而在腎臟損害的患者中是升高的;(2)即使在腎功能中度損害的患者中,Hepcidin也與鐵供應密切相關,并隨著鐵的水平而變化,而與炎性介質(zhì)沒有明顯的關系;(3)雖然Hepcidin高水平與血色素降低有關,但是,其與EPO低濃度有很強的相關性。Hepcidin水平在腎臟疾病患者中升高并不預測紅細胞生成素需要增加,而可能是EPO抵抗?jié)撛诘臉酥?。Hepcidin水平在腎臟疾病患者中是升高的,其既反應腎臟損傷程度,又反應了鐵儲藏。

也有研究表明,EPO也可抑制Hepcidin水平。Nicolas等[6]給小鼠注射EPO時,發(fā)現(xiàn)肝細胞Hepcidin表達水平在注射后24、48 h幾乎完全受抑。Ashby等[19]也觀察到 Hepcidin水平在一般腎臟病患者使用EPO治療時下降。且在動物模型中,當開始靜脈注射EPO以刺激紅細胞生成時,Hepcidin mRNA水平被充分抑制。Hepcidin的表達調(diào)控是與體內(nèi)紅系造血對鐵代謝的需求密切相關的,當造血旺盛時,Hepcidin呈低表達,一方面可提高腸道鐵的吸收,另一方面可動員網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的鐵,以保證造血對鐵的需要。而腎臟疾病患者鐵代謝是紊亂的。CRE患者使用EPO能抑制Hepcidin,改善混亂的鐵運輸和治療EPO缺乏。但對Hepcidin引起EPO抵抗機制尚需進一步研究。

此外,隨著腎功能的減退,Hepcidin可在體內(nèi)蓄積,不同透析方式對殘余腎功能的影響可使Hepcidin的清除受到不同程度的影響[17]。對此引起的原因尚需深入研究。

3.2 Hepcidin與腎細胞癌 Ashby等[19]在32例患者中用液相質(zhì)譜儀(LC-MS)測定Hepcidin-25水平及Hepcidin mRNA在配對腫瘤及非腫瘤患者中的表達。來源于53例手術患者的組織樣本,經(jīng)實時逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應證實存在腎細胞癌。在這個研究中有3個發(fā)現(xiàn):(1)有轉(zhuǎn)移的腎細胞癌患者血漿hepcidin-25水平高于無轉(zhuǎn)移者;(2)Hepcidin mRNA的表達在有轉(zhuǎn)移的腎細胞癌的患者中高于無轉(zhuǎn)移者;(3)腫瘤患者中Hepcidin mRNA的高表達對腎細胞癌總的生存率是不利的。文中提出:血漿中Hepcidin水平在炎癥、CRP水平升高、多發(fā)性骨髓瘤及慢性腎臟疾病患者中升高,這預示Hepcidin改變是受生理、病理及遺傳因素的影響而造成鐵代謝紊亂所致。Hepcidin-25濃度在有腎細胞癌(RCC)轉(zhuǎn)移的患者中明顯增高。腫瘤組織中Hepcidin mRNA表達低于非腫瘤組織,但是當RCC出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時,其表達也增加。Hepcidin mRNA表達水平在腫瘤組織轉(zhuǎn)移是一致,但是與組織分化和腫瘤的發(fā)展階段不一致。引起患者Hepcidin改變與鐵調(diào)控有關。鐵為HPHs催化活性的輔助因子,并為細胞生長及細胞周期提供營養(yǎng)。據(jù)報道鐵在腎細胞癌組織中的含量比在非腫瘤細胞中豐富。Hepcidin mRNA表達在有轉(zhuǎn)移的腎細胞癌中明顯高于無轉(zhuǎn)移者。這預示著Hepcidin mRNA表達的增加可能與腫瘤組織中鐵含量增加有關。Hepcidin在不同的腫瘤中扮演的角色是不同的。但是,鐵的增加是建立在Hepcidin mRNA表達增加的基礎上,可能對腎細胞癌的轉(zhuǎn)移是必須的。如前所述,Hepcidin通過引起腸細胞、肝細胞和巨噬細胞中膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)陷和降解來調(diào)節(jié)血漿中鐵的代謝。另外,Hepcidin在炎癥時水平升高,其是一種炎癥急性期反應物,表現(xiàn)其抗菌活性。因而,其在有轉(zhuǎn)移的腎細胞癌患者中升高可能是通過上調(diào)腫瘤細胞Hepcidin的水平來預防腫瘤細胞利用鐵。Hepcidin-25可以作為 RCC的預后指標之一。這項研究通過Kaplan-Meier分析顯示Hepcidin mRNA過度表達與 RCC患者總體生存率縮短有關。提出Hepcidin mRNA的水平對該類患者總體生存率是獨立的預后因素。

3.3 Hepcidin與急性腎損傷(AKI)AKI是冠狀動脈旁路移植術嚴重的并發(fā)癥,一旦發(fā)生,無特殊有效的治療手段,超過60%患者會死亡。AKI在早期階段難以用非侵襲的手段獲得診斷。Julie等[20]用前瞻性巢氏研究的方法對比了冠狀動脈旁路移植術中心肺旁路手術術中、術后發(fā)生AKI 22例患者和未發(fā)生AKI 22例患者一系列的尿蛋白的指標,發(fā)現(xiàn)相對于AKI患者,非 AKI患者 Hecidin-25明顯升高。也有研究表明,在被慶大霉素誘導的AKI的小鼠模型中,自由基引起的損傷可以被去鐵胺(一種鐵的螯合劑)所改善。而Hepcidin是維持鐵穩(wěn)態(tài)至關重要的因素。其通過結合腸細胞、肝細胞、巨噬細胞上的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白受體間接將胞內(nèi)的鐵鎖定,使膜鐵蛋白內(nèi)化、降解。Hepcidin在腎臟的遠端直管、皮質(zhì)集合管、集合小管的管狀上皮細胞頂端表達。hepcidin-25是對AKI的適應性反應,其可以將細胞內(nèi)的鐵鎖定,而細胞內(nèi)的鐵鎖定有助于局限腎臟缺血-再灌注損傷。其可能起到類似外源性去鐵胺的作用而改善AKI。Hecidin-25可以作為預測早期AKI的一個指標,同時也對AKI的治療提供了新的思路。

4 結 語

Hepcidin作為一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥急性期反應蛋白,參與對貧血、組織缺氧和炎癥的機體反應,是鐵代謝重要的負性調(diào)節(jié)素,對固有免疫、慢性炎癥性貧血等與鐵代謝相關性疾病有重要作用。近年來,其在炎癥反應中的作用正逐漸被重視,對Hepcidin活性分子學的機制研究可改變對鐵轉(zhuǎn)運的理解,并可能找到一種治療血色病和炎癥性貧血的新途徑。由此,Hepcidin在腎臟疾病中的作用將會更加明確,從而為治療提供新的途徑。

[1]Martin GB,Mansion F,Servais AC,et al.CE-MS methos development for peptides analysis,dspecially hepcidin,an iron metabolism marker[J].Electrophoresis,2009,30(15):2624.

[2]Krause A,Neitz S,Magert HJ,et a1.LEAP-1,a novel highly disulfide-bonded human peptide,exhibits antimicrobial activity[J].PEBS Lett,2000,480(2/3):147.

[3]Park CH,Valore EV,Warning AJ,et a1.Hepcidin,a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver[J].J Biol Chem,2001,276(11):7806.

[4]Pigeon C,Ilyin G,Courselaud B,et al.A new mouse liverspecific gene,encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin,is overexpressed during iron overload[J].J Biol Chem,2001,276(11):7811.

[5]Hunter hn,Fulton DB,Ganz T,et a1.The solution structure of human hepcidin,a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis[J].Biol Chem,2002,277(40):37597.

[6]Nicolas G,Viatte L,Bennoun M,et al.Hepcidin,a new iron regulatory peptide[J].Blood Cells,M olecules,and Diseases,2002,29(3):327.

[7]Gagliardo B,Kubat N,Gaye A,et al.Pro-hepcidin is unable to degrade the iron exporter ferroportin unless maturated by a furin-dependent process[J].J Hepatol,2009,50(2):394.

[8]李娜,郭俊生,秦海宏.Hepcidin與鐵代謝[J].國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊,2007,34(3):162.

[9]Nemet HE,Tuttle MS,Powelson J,et al.Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization[J].science,2004,306(5704):2090.

[10]Domenico I,Ward DM,Langelier C,et al.The molecular mechanism of hepcidin-mediated ferroportin down-regulation[J].Mol Biol Cell,2007,18(7):2569.

[11]Ganz T.Hepcidin:A Regulator of intestinal iron absorption and iron recycling by macrophages[J].Best Pract Clin Haematol,2005,18(2):171.

[12]Lesbordes-Brion JC,Viatte L,Bennoun M,et al.Targeted disruption of the hepcidin 1 gene result s in severe hemochromatosis[J].Blood,2006,108(4):1402.

[13]Erwin HJM,Kemna-April ER,Lambertus JH,et al.Regulation of hepcidin:Insights from biochemical analyses on human serum samples[J].Blood Cell Mol Dis,2008,40(3):339.

[14]Pauline L,Hongan P,Terri G,et a1.The IL-6 and lipopolysaccharide-induced transcription of hepcidin in HFE-transferrin receptor and β2-microglobulin-deficient hepatocytes[J].Proc Acad Sci USA,2004,101(25):9263.

[15]Laftah AH,Ramesh B,Simpson RJ,et al.Effect of hepcidin on intestinal iron absorption in mice[J].Blood,2004,103(10):3940.

[16]Nicolas G,Chauvet C,Viatte L,et al.The gene that codes for hepcidin,an iron regulatory hormone,is regulated by anemia,hypoxia,and inflammation[J].Clin Invest,2002,110:1037.

[17]Valenti L,Girelli D,Valenti GF,et al.HFE mutations modulate the effect of iron on serum hepcidin-25 in chronic hemodialysis patients[J].Clin J Am Soc Nephrol,2009,4(8):1331.

[18]吳曉亮,戴世學.Hepcidin-25配合促紅細胞生成素治療大鼠腎性貧血的療效分析[J].實用醫(yī)技雜志,2008,15(16):2055.

[19]Ashby DR,Gale DP,Busbridge M,et al.Plasma hepcidin levels are elevated but responsive to erythropoietin therapy in renal disease[J].Kidney Int,2009,75(9):976.

[20]Julie H,Lucy M,Krokhin O,et al.Mass spectrometrybased proteomic analysis of urine in acute kidney injury following cardiopulmonary bypass:a nested case-control study[J].Am J Kidney Dis,2009,53(4):584.