孫迪文

新輔助化療后乳腺癌組織中survivin表達(dá)情況與腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖的關(guān)系及其對(duì)乳腺癌化療敏感性和療效預(yù)測(cè)的臨床意義，目前報(bào)道較少[1]。

本研究應(yīng)用免疫組化SABC法，檢測(cè)60例術(shù)前行新輔助化療及60例術(shù)前未行新輔助化療的乳腺癌組織中survivin和Ki-67的表達(dá)情況，同時(shí)采用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，從不同層面對(duì)新輔助化療后乳腺癌組織的變化進(jìn)行全面觀察，旨在探討其相關(guān)性和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取我院2003年3月～2005年6月收治臨床資料完整術(shù)前行新輔助化療的60例乳腺癌石蠟包埋標(biāo)本作為研究對(duì)象，以同期60例術(shù)前未行新輔助化療的病例作為對(duì)照組。全部病例均為浸潤(rùn)性乳腺癌，其中包括浸潤(rùn)性特殊癌4例(乳頭狀癌2例、髓樣癌1例、黏液腺癌1例)和浸潤(rùn)性非特殊癌56例(浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌45例、浸潤(rùn)性小葉癌7例、髓樣癌1例、硬癌2例、單純癌1例)；均行改良根治術(shù)。60例新輔助化療組患者化療前均經(jīng)粗針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)為乳腺癌，均為女性，年齡34～69歲，平均年齡46.2歲，中位年齡45歲。TNM分期：Ⅱb期21例；Ⅲa期25例；Ⅲb期14例。對(duì)照組60例患者，均女性，年齡32～70歲，平均年齡47.3歲，中位年齡46歲。TNM分期：Ⅱb期23例；Ⅲa期24例；Ⅲb期13例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組織化學(xué)染色。采用SABC免疫組織化學(xué)方法(鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物 SABC)檢測(cè)survivin和Ki-67的表達(dá)。嚴(yán)格按照試劑盒說明要求進(jìn)行操作，一抗稀釋度1∶100，微波修復(fù)抗原，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照(survivin陽(yáng)性對(duì)照片為結(jié)腸癌，Ki-67陽(yáng)性對(duì)照片為皮膚切片)，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗人PTEN多克隆抗體(即用型 1∶100)和兔抗人VEGF抗體(即用型 1∶100)均購(gòu)自Santa Gruz公司，即用型SABC試劑合和DAB染色試劑購(gòu)自武漢博士德試劑公司。

1.2.2 細(xì)胞凋亡 采用原位細(xì)胞末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記法(TUNEL法)測(cè)定細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照試劑盒說明要求進(jìn)行操作，用DAB顯色，用已送的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 化療后癌組織病理形態(tài)學(xué)改變及化療療效判定標(biāo)準(zhǔn) 化療療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)分為三級(jí)[2]：Ⅰ級(jí)為完全緩解(相當(dāng)于臨床的cCR)，即腫瘤原發(fā)灶消失，完全被纖維組織取代(Ⅰa級(jí))或肉眼無腫塊，僅在顯微鏡下看到少量殘存的癌細(xì)胞(Ⅰb級(jí))；Ⅱ級(jí)為部分緩解(相當(dāng)于臨床的cPR，見圖1)，既原發(fā)灶>60%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)變形或壞死(Ⅱa級(jí))或原發(fā)灶20%～60%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)變形或壞死(Ⅱb級(jí))；Ⅲ級(jí)為無效(相當(dāng)于臨床的NC)，既原發(fā)灶<20%腫瘤細(xì)胞有輕度的變形、壞死或者沒有明顯的變化。CR+PR為總有效率。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) survivin免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，部分胞膜表達(dá)。Ki-67免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，定位于細(xì)胞核內(nèi)。采用半定量積分法[2]，將染色強(qiáng)度分為3級(jí)：無著色記1分，淺著色記2分，棕黃色記3分；按陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分比分3級(jí)：≤25%為一級(jí)記1分，26%～75%為二級(jí)記2分，≥76%為三級(jí)記3分。每張切片最后的得分為兩次評(píng)分的乘積(1～9)，≥3分為陽(yáng)性，≤3分為陰性。

1.3.3 細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的測(cè)定 采用TUNEL法，檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，共記數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞。凋亡細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分率即凋亡指數(shù)[AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)(1000)×100%]。

1.4 化療方法

新輔助化療組60例患者，術(shù)前均應(yīng)用CTF方案化療2個(gè)周期，化療結(jié)束后兩周行改良根治術(shù)。CTF方案：吡柔吡星(THP)500 mg/m2，第1天靜脈推注；環(huán)磷酰胺(CTX)600 mg/m2，第1、8天靜脈推注；5-氟脲嘧啶(5-Fu)500 mg/m2，第1、8天靜脈滴注；28天為1個(gè)周期。對(duì)照組60例患者，術(shù)前未行化療。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較，采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，survivin和Ki-67及 AI之間的關(guān)系用線性相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織中survivin和Ki-67的表達(dá)情況

新輔助化療組survivin陽(yáng)性表達(dá)率為36.7%(22/60)，明顯低于對(duì)照組(71.7%，43/60 )(χ2=14.821，P<0.01)。新輔助化療組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率為38.3% (23/60)，明顯低于對(duì)照組(61.7%，37/60；χ2=6.533，P<0.05)。

2.2 乳腺癌組織中細(xì)胞凋亡情況

正常乳腺組織、腫瘤組織及間質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞，但在腫瘤壞死周圍的凋亡細(xì)胞明顯增多。新輔助化療組AI平均為(9.34±3.12)%；對(duì)照組AI平均為(5.27±3.16)%，t=1.998，P<0.05。

2.3 新輔助化療后病理形態(tài)學(xué)改變及其與survivin表達(dá)的相關(guān)性

60例新輔助化療患者中完全緩解(pCR)為0例，44例部分緩解(pPR)，16例無變化(NC)，新輔助化療總有效率為73.3%(44/60)。新輔助化療后病理形態(tài)學(xué)改變Ⅱ級(jí)病例的survivin陽(yáng)性表達(dá)率(18.2%，8/44)，明顯低于Ⅲ級(jí)病例(81.3%，13/16)(χ2=20.514，P<0.001)。

2.4 survivin表達(dá)與Ki-67表達(dá)及AI的關(guān)系

survivin和AI之間的相關(guān)系數(shù)γ=-0.36(P<0.05)，survivin表達(dá)與Ki-67表達(dá)的相關(guān)系數(shù)γ=+0.47(P<0.05)。說明survivin表達(dá)與癌細(xì)胞的AI呈負(fù)相關(guān)，而與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

研究表明，乳腺癌具有易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，在全部初診乳腺癌患者中，有半數(shù)以上已發(fā)生血道轉(zhuǎn)移[3，4]。因此，新輔助化療已成為乳腺癌綜合治療的重要組成部分。

為了提高新輔助化療后腫瘤的緩解效果，目前，新輔助化療多采用聯(lián)合化療方案。大量臨床研究顯示，CTF方案是目前經(jīng)典的乳腺癌化療方案之一，治療乳腺癌緩解率高，而脫發(fā)和心臟毒性明顯降低，更適合長(zhǎng)期、系統(tǒng)的化療。本研究采用該方案對(duì)60例乳腺癌患者進(jìn)行新輔助化療，均能良好耐受，未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，總有效率達(dá)73.3%，進(jìn)一步說明CTF方案新輔助化療療效好。

survivin是凋亡抑制蛋白(IPA)家族的新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙功能蛋白，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子。Survivin在多種腫瘤等增殖細(xì)胞中有不同程度表達(dá)[3～5]。Satoh研究發(fā)現(xiàn)[4]，胰腺癌survivin陽(yáng)性表達(dá)率76.9%，survivin表達(dá)上調(diào)與AI有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)survivin表達(dá)水平新輔助化療組顯著低于對(duì)照組，而在新輔助化療組其表達(dá)水平與化療后病理形態(tài)學(xué)改變分級(jí)密切相關(guān)，其在術(shù)前化療后部分緩解(Ⅱ級(jí))病例的表達(dá)水平顯著低于無效者(Ⅲ級(jí))，提示術(shù)前CTF方案化療可部分抑制乳腺癌細(xì)胞survivin的表達(dá)，這可能是新輔助化療抑制腫瘤的機(jī)制之一。

通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)展的重要手段，大多數(shù)的化療藥物都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡消除腫瘤細(xì)胞[3～5]。Davis等[5]報(bào)道，對(duì)乳腺癌采用docetaxel聯(lián)合doxorubicin新輔助化療的病例，在化療前和化療后24、48 h分別取腫瘤組織測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡水平變化顯示，化療后48 h測(cè)得的細(xì)胞凋亡水平值最高，化療病理反應(yīng)與細(xì)胞凋亡程度呈明顯正相關(guān)。本研究顯示，新輔助化療組較對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的AI明顯提高(9.34% v 5.27%)，從而提示有效的新輔助化療可促進(jìn)乳腺癌的凋亡。

通過誘導(dǎo)降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力是抑制腫瘤發(fā)展的另一重要手段。Ki-67抗原是目前公認(rèn)的1種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白，其表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，它在G1后期開始出現(xiàn)，在S期和G2期逐漸升高，M期達(dá)到高峰，有絲分裂后逐漸降解消失，半衰期僅為1h甚至更短，且不表達(dá)于DNA修復(fù)狀態(tài)的細(xì)胞，因此能準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，并與多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[6]。Parton等[6]發(fā)現(xiàn)，化療藥物作用于乳腺癌細(xì)胞24 h以后，Ki-67水平顯著降低。本研究顯示新輔助化療組患者腫瘤細(xì)胞的Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，從而提示新輔助化療可使腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞活性下降。

我們分析了survivin表達(dá)與AI值的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)survivin表達(dá)水平與癌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說明survivin的異常表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡起一定抑制作用。Yu等[7]在對(duì)胃癌和Satoh等[4]對(duì)胰腺癌的研究中都證實(shí)了這一點(diǎn)。Tanaka等[1]采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了167例乳腺癌組織中survivin表達(dá)，陽(yáng)性率為70.7%，且survivin表達(dá)與AI有明顯的相關(guān)性。

我們也分析了survivin表達(dá)與Ki-67的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，說明survivin不僅參與了凋亡調(diào)控，還促進(jìn)了細(xì)胞增殖。Survivin促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制可能為survivin蛋白通過競(jìng)爭(zhēng)性地與周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的復(fù)合物(主要為CyclinD-CDK4)結(jié)合，使得細(xì)胞蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白(CKI 如P21蛋白)從上述復(fù)合物中釋放出來，解除了DNA復(fù)制依賴因子—Ki-67的抑制，增強(qiáng)了CDK的活性，從而使G1→S期促進(jìn)細(xì)胞增殖。

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