張 亞 王學春

(泰山醫(yī)學院，山東 泰安 271016)

蛋白質組學是研究細胞內所有蛋白質及其動態(tài)變化規(guī)律的科學[1],近年來它被廣泛應用于生命科學的各個領域。蛋白質組的研究不僅有助于揭示生命活動規(guī)律，還能為眾多種疾病機理的闡明及攻克提供理論依據(jù)和解決途徑。通過對正常個體及病理個體間的蛋白質組比較分析，可以找到某些“疾病特異性的蛋白質分子”[2]，它們可能為疾病的早期診斷提供一些新的分子標志。消化道腫瘤是我國死亡率最高的疾病之一。在過去30年中, 針對腫瘤的研究, 尤其是在致癌機制方面, 取得了顯著的進展。然而, 臨床檢測及治療上的進展卻相對緩慢。蛋白質組學的引入, 通過提供大規(guī)模高通量的蛋白質分析的技術手段, 為腫瘤蛋白質標志物的檢測提供了新方法, 為腫瘤的診斷及治療提供了新途徑。本文重點綜述了蛋白質組學技術在消化系統(tǒng)腫瘤中的應用。

1 蛋白質組學概述及其相關技術

1994年，澳大利亞科學家Wilkins和Williams首次提出了蛋白質組學(proteomics)概念，蛋白質組學主要是系統(tǒng)性研究一種基因組、一種生物，或者一種細胞(組織)所表達的全套蛋白質[1]。其目的是從整體的角度分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)、了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。由于蛋白質是組織、細胞功能的主要執(zhí)行者，是基因通往細胞功能的橋梁，因此蛋白質組學能更真實、更直接地體現(xiàn)生命現(xiàn)象的本質，能更深入地揭示各種復雜生命活動的機制。蛋白質組學的核心技術包括樣品制備、分離、鑒定和生物信息分析等。

1.1 樣品制備

樣品制備是蛋白質組分析成功與否的關鍵,應具有良好重復性,并與后續(xù)分離和鑒定方法相匹配。與核酸不同，目前沒有一種通用的方法適用于所有的蛋白質，不同來源的樣本需要不同的提取和裂解技術。近幾年發(fā)展起來的激光捕獲顯微切割技術(laser capture microdissection，LCM)是一項可以直接從組織樣品中獲取特異細胞群的技術，該技術對雙向電泳的標本制備具有重要作用，可以精確地從組織切片中取出研究者感興趣的細胞類型，從而獲得純凈的蛋白質樣品，是目前解決組織異質性操作中較理想的方法[3]。

1.2 蛋白質分離技術

目前，由O’Farrell PH等人[4]發(fā)明的雙向電泳技術( Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 2D-PAGE) 仍是獲得蛋白質圖譜的主要手段，其原理是根據(jù)蛋白質等電點和分子量的不同將蛋白分離。2-DE的缺點是重復性差, 對膜蛋白兼容性差, 缺乏小分子量和大分子量的信息, 對于極端pH的蛋白也無法分辨檢測。針對重復性差的問題,產(chǎn)生了熒光標記的2-DE, 也就是 DIGE(diferential in gel electrophoresis)技術[5]。該技術運用不同的熒光染料分別標記不同的蛋白質樣品,然后將它們等量混合起來,在單一的雙向膠上進行分離和檢測,按照它們所發(fā)出熒光的不同,來比較在不同細胞狀態(tài)下蛋白質量的變化。DIGE可對圖譜上蛋白質點之間的差異表達進行研究,進一步提高2-DE的重復性及蛋白質的真實改變程度,其不足主要在于樣本數(shù)量的局限性。

近年來新的分離蛋白質的非凝膠技術得到發(fā)展，并在蛋白質組學研究中廣泛應用，這些非凝膠技術的應用簡化了蛋白質組研究步驟，又可與質譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化，是2-DE技術的有效補充。液相色譜法/高效液相色譜(high performance liquid chromatography， HPLC)是近年來發(fā)展迅速的非凝膠的新方法，具有高分辨率，可直接用于高復雜性蛋白質混合物的分析，對低豐度蛋白的檢測能力超過2D-PAGE[6]。毛細管電泳是目前對生物大分子分辨率很高的分離分析技術。即在高電場強度作用下,對毛細管(內徑5～10 μm) 中的待測樣品按分子質量、電荷、電泳遷移率等差異進行有效分離。具有進樣量小,可操作性強,分離高效、快速的特點,并且易于同其他監(jiān)測方法連用,是微分離分析中最有效的方法之一。該技術彌補了雙向凝膠電泳無法實現(xiàn)自動化分析的不足,并可用于分子量范圍不適用于雙向電泳樣品的檢測,對單一樣品尤為適用,但對復雜樣品的分離尚不完全[7]。

1.3 蛋白質鑒定技術

蛋白質鑒定主要依靠質譜技術(MS)分析。電噴霧質譜(ESI - MS)和基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF -MS)技術的發(fā)明及在蛋白質分析中的成功應用,使具有極高靈敏度的質譜技術成為蛋白質組研究的核心工具,其基本原理是通過電離源先將樣品分子離子化,再根據(jù)各離子間荷質比(m/z)的差異分離蛋白質,并確定其分子量和PI等屬性參數(shù)[8]。表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(SELDI - TOF - MS) 技術是近年出現(xiàn)的,是目前蛋白質組學最常應用的技術,該技術是利用經(jīng)過特殊處理的固相支持物或芯片的基質表面,制成蛋白質芯片,根據(jù)蛋白質生化特性不同,選擇性地從待測生物樣品中捕獲配體,將其結合在芯片的固相基質表面上,利用激光脈沖輻射使芯片表面的待分析物解析成帶電離子,質荷比不同的離子在電場中飛行時間不同,據(jù)此繪制出質譜圖。檢測結果經(jīng)過軟件處理后可直接顯示樣品中各種蛋白質的分子量、含量等信息[9]。 SELDI - TOF - MS 技術不需要雙向電泳預先分離蛋白質,可直接從各種體液和組織中找出疾病相關蛋白質,獲得樣品中目標蛋白質的分子量。此檢測技術靈敏度高,具有高通量、快速、操作簡便、樣品用量少和對多種樣品平行分析檢測等特點,具有很好的臨床應用前景[10]。

1.4 生物信息分析

2-DE所得到的圖像可利用圖像分析軟件進行分析, 通過數(shù)據(jù)庫查詢質譜結果, 還可對感興趣的未知蛋白質進行結構和功能方面的分析。

2 蛋白質組學在消化系統(tǒng)腫瘤中的應用

2.1 肝癌

近年來肝癌發(fā)病率在我國有上升趨勢，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的前列。肝癌的預后極差，五年生存率低于5%[11]。Sun S等[12]應用2-DE技術尋找肝細胞性肝癌中潛在的參數(shù)標志物，他們對224例肝組織標本(105例癌組織，103例癌旁組織和16例正常組織)進行雙向電泳分析，發(fā)現(xiàn)β-actin(ACTB)、heat shock protein 60(HSP60)和protein disulphide isomerase(PDI)三種蛋白標志物在不同組織中的變化比較穩(wěn)定。同時應用Western blot、免疫組化、實時定量PCR進行驗證，證實ACTB和HSP60變化情況與2-DE結果基本一致。他們認為ACTB和HSP60有望成為肝癌早期診斷的可靠蛋白參數(shù)標志物。Codarin E等[13]應用2-DE和MALDI-TOF-MS分析技術對20名肝癌患者的癌組織及配對癌旁組織進行研究，得到包括200個普通蛋白點在內的蛋白質圖譜，其中證實含有52個差異基因相對應的蛋白表達產(chǎn)物。通過蛋白差異分析發(fā)現(xiàn)16個明顯變化的蛋白點，這些蛋白與組成細胞骨架，應激反應和發(fā)揮代謝功能相關。本項研究可能為肝癌診斷提供新的蛋白標記物并且為肝癌病理變化和轉移機制提供新的思路。Li N等[14]聯(lián)合應用2-DE和MALDI-TOF質譜技術比較分析了18例肝癌組織及癌旁組織(包括12例LC源性和6例慢性乙型肝炎源性肝細胞肝癌)之間蛋白質表達譜的差異，鑒定了17 個具有顯著性表達差異的蛋白質，其中十個蛋白點在癌組織中上調，其余7個蛋白點下調。而c-Jun N-terminal kinase 2 和 ADP/ATP carrier protein 僅在慢性乙型肝炎源性肝癌(CHB)組織中上調，nsulin-like growth factor binding protein 2和Rho-GTPase-activating protein 4分別只在LC源性和CHB源性肝癌組織中下調。另外該實驗還發(fā)現(xiàn)在HBV源性肝癌組織中有6個新的差異表達蛋白。

2.2 胃癌

胃癌仍是全世界最常見的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤患者最常見的死亡原因之一。胃癌目前在世界范圍內癌癥相關死亡中列第二位，在我國居于首位。僅2002年全球范圍內就有新增患者約90萬例，死亡人數(shù)超過70萬例。胃部腫瘤很少在臨床前期被發(fā)現(xiàn)或確診，從而導致預后普遍較差[15]。 2003年，Ryu JW等[16]比較胃癌與正常胃黏膜組織的蛋白組差異，得到1500個蛋白點，對140個蛋白點進行鑒定，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中有7 個上調蛋白質：NSP3、 Prohibitin 、Transgelin、熱休克蛋白27及其變異體、二硫化物異構酶A3蛋白、葡萄糖相關蛋白等；7 個下調蛋白點：載脂蛋白A-1、P20、二磷酸核苷異構酶A、α1-抗胰蛋白酶、支架蛋白、血漿白蛋白和血清轉鐵蛋白。2009年Mohri Y等[17]運用SELDI技術檢測胃癌組織和血清：組織分析發(fā)現(xiàn)115個差異位點，其中包括HNPs1-3在內的上調蛋白位點65個，下調蛋白位點50個；血清中發(fā)現(xiàn)MIF蛋白位點上調。2007年中科院張軍等[18]應用2-DE和MALDI-TOF/TOF MS技術發(fā)現(xiàn)胃癌組織中12個上調和13個下調蛋白點；他們認為MAWBP可能成為胃癌新的蛋白標志物之一。2008年第二軍醫(yī)大學吳成等[19]應用2-DE和MALDI-TOF MS方法研究胃癌標志物，發(fā)現(xiàn)9個上調點：HSP60、肌間線蛋白、 效應細胞蛋白酶受體1、 MnSOD 、plice form 1b、 hypothetical protein、 unnamed protein product；20個下調點：硒結合蛋白1、纖維蛋白原、HSP27、微管蛋白α6、鋅指蛋白160、前列腺合酶F、真核翻譯延伸因子-α1。他們認為MnSOD有可能成為胃癌新的蛋白標志物。

2.3 食管癌

食管癌在我國的發(fā)病率和死亡率均居于惡性腫瘤的前列，但病因學與發(fā)病機制至今不甚明了。食管癌的發(fā)生演進是一個多層次、多因素導致的復雜過程，其產(chǎn)生發(fā)展涉及多種基因與蛋白的協(xié)同作用。近年來有關食管癌的研究主要集中在癌基因/抑癌基因的改變與食管癌的相互關系，如myc、ras、EGFR、Cyclin D1、p53、Rb等。蛋白質組學技術已越來越廣泛的應用于致癌機制的研究以及腫瘤相關蛋白的鑒定。Xu SY等[20]采用SELDI-TOF-MS和CM10蛋白質芯片技術分析了139例食管鱗狀細胞癌(ESCC)病人和49例正常對照者血清樣本,發(fā)現(xiàn)了283個血清蛋白峰(0～20kDa),其中140個蛋白峰在食管癌病人和正常對照者血清中出現(xiàn)顯著差異。該實驗建立了一個由六個蛋白峰(m/z 5667, 5709, 5876, 5979, 6043，6102)組成的診斷模型，利用統(tǒng)計學分析軟件,診斷的敏感性達到97.12%,特異性達到83.87%,研究表明這是一項有前途的早期診斷ESCC準確率高且無創(chuàng)的方法。Uemura N等[21]為尋找食管癌的預后標記物，采用熒光差異顯示凝膠電泳(2D-DIGE)技術分離并篩選不同熒光素標記的預后好(9例生存率超過5年且無復發(fā)跡象的患者)和預后差(24例術后2年死亡的患者)的食管癌組織的差異表達蛋白質，用質譜(MS)技術進行鑒定并分析。結果共篩選出22個具有統(tǒng)計學意義的差異表達蛋白質點。其中發(fā)現(xiàn)Transglutaminase 3(TGM3)與食管癌患者預后程度呈負相關。另外又對76名不同預后程度ESCC患者的TGM3水平進一步進行免疫組化檢測：TGM3陽性患者5年生存率為64.5%，TGM3陰性患者5年生存率為32.1%。這項研究首次表明TGM3可作為食管癌新的預后標記物，TGM3表達水平的監(jiān)測有望為預防ESCC復發(fā)提供一種新的治療策略。Fu等[22]對分化程度不同的食管鱗狀上皮細胞癌所表達的蛋白質組進行研究。與正常食管組織相比,在食管鱗狀上皮細胞癌中有18個蛋白位點表達出現(xiàn)差異,其中alpha-actinin 4 (ACTN4) 和67 kD laminin receptor ( 67LR)的表達水平從腫瘤I期到III期漸升。用組織微陣列技術( tissue microarrays, TMA)研究其與臨床病理學的聯(lián)系,揭示了ACTN4過表達與腫瘤的侵襲、轉移潛能有關,但67LR的過表達則只與腫瘤的惡性程度有關。他們認為該兩種蛋白可以成為食管鱗狀上皮細胞癌診斷和治療的靶點。

2.4 結直腸癌

結直腸癌是臨床常見的消化道腫瘤之一，在各種惡性腫瘤中居第3位,在癌癥導致死亡的病因中占第四位，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且整體治療水平不盡人意。臨床上30 %～40 %的患者在就診時已屬中晚期,實施根治性切除術后腫瘤的復發(fā)轉移率仍高達40 %～70 %[23]。Kim等[24]運用功能蛋白質組學方法對結直腸癌轉移和侵襲潛能進行研究，發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡糖胺基轉移酶v(GnT-V)能使金屬蛋白酶-1抑制因子(TMP-1)的糖基化過程發(fā)生異常改變，這種異常糖基化使TMP-1對基質金屬酶-2，9的抑制作用減弱，從而間接地增強結直腸癌轉移和侵襲的潛能。盛新華等[25]收集結直腸癌(68例)、其他惡性腫瘤(乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌及腎癌各25例)血清標本共218份，應用表面增強激光解吸/電離-飛行時間-質譜檢測其蛋白質指紋譜。用Biomarker Wizard軟件分析結直腸癌與其他惡性腫瘤患者血清中的低分子差異蛋白后，分別作出受試者工作特征(ROC)診斷曲線。再選取ROC曲線下面積(AUC)>0.8的蛋白，建立Fisher判別模型。結果顯示結直腸癌與其他惡性腫瘤相比，血清中有12種蛋白相對高表達，102種蛋白相對低表達。ROC曲線顯示，有75種蛋白AUC>0.5，其中8911、8919、8964、11726、14049、14139 M/Z的蛋白AUC>0.8。 用這6種蛋白建立的Fisher判別模型， 鑒別結直腸癌的敏感性88.2%，特異性93.3%，準確率91.7%。他們認為結直腸癌與其他惡性腫瘤相比，血清中存在明顯差異表達的低分子蛋白，對結直腸癌具有診斷特異性， 值得進一步研究。

2.5 胰腺癌

胰腺癌是外科治療效果最差的腫瘤之一，其5年生存率不足3%[26]。Kakisak 等[27]研究了異常表達的胰腺癌患者的血漿蛋白質。分別取胰腺癌病人與健康對照組的血漿，在去除高峰度蛋白后進行熒光雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)。2D-DIGE 構建的胰腺癌病人和健康對照組的血漿蛋白差異表達圖譜顯示：胰腺癌病人血漿33個差異表達的蛋白點，其中27個上調、6 個下調。經(jīng)質譜鑒定和生物學分析，上調的亮氨酸富集α-2-糖蛋白(LRG)以前從未在胰腺癌蛋白質研究文獻中涉及，而且通過了免疫組化驗證，提示該檢測可作為胰腺癌診斷、鑒別診斷的重要指標，此研究推進了臨床LRG 血漿水平的測量。金紅等[28]采用雙向凝膠電泳和生物質譜技術，對12對胰腺癌組織和癌旁組織樣品、3個胰腺良性疾病樣品、3個正常胰腺組織樣品的蛋白質進行了分離和鑒定, 獲得了重復性較好的雙向凝膠電泳圖譜；鑒定了胰腺癌和癌旁組織的差異表達蛋白質, 發(fā)現(xiàn)了30個差異表達蛋白質；應用MALD I-TOF-MS/MS技術對差異表達蛋白質進行鑒定, 共有24個蛋白質得到鑒定, 其中15個蛋白質在胰腺癌組織中表達上調， 9個蛋白質表達下調。這些蛋白質與胰腺癌的發(fā)生相關，可能成為胰腺癌的分子標志物和藥物治療的靶蛋白。

3 不足和展望

由于蛋白質組是一個動態(tài)、變化的整體，生物體內的蛋白質不能像核酸一樣通過PCR擴增來增加樣品量，因此其復雜性遠遠大于基因組。而蛋白質組學可以從整體、動態(tài)、網(wǎng)絡水平上研究蛋白質,為詮釋復雜生命活動提供新視角,有助于深入了解疾病過程中潛在的分子機制。目前，運用蛋白質組技術分離和鑒定腫瘤標志物的研究還處在初級階段，那些被發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤相關的蛋白標志物還需進一步擴大樣本量，通過嚴格的對照來評價其特異性。由于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多步驟和多基因參與的十分復雜的過程，結合基因組所提供的大量信息，相信使用蛋自質組技術將會大大加快對腫瘤標志物的研究進程。

[1] Willkins MR，Sanchez JC，Cooley AA，et al．Progress with proteome projeets：why all proteins expressed by a genome should be identified and howto doit[J]．Biotechnology，1995，13(1)：19-50.

[2] Gygi S，Han DK，Gingras AC，et al．Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching tools for cancer research in the post-genomicera[J]．Electrophoresis，1999,20：3l0-319.

[3] Banks RE，Dunn MJ，F(xiàn)orbes MA，et al．The potential use of laser capture micmdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic an alysispreliminary findings[J]．Electrophoresis，1999，20：689-700.

[4] O’Farrell PH. High resolution two2dimensional electrophoresis of proteins[J]. J Biol Chem,1975 ,250 (10) :4007-4021.

[5] Unlü M, Morgan M E, Minden J S.Difference gel electrophoresis. a single gel method for detecting changes in protein extracts[J]. Electrophoresis,1997, 18( 11) : 2071- 2077.

[6] Tyan Y C，Wu H Y，Lai W W，et al. Proteomic profiling of human pleural effusion using two-dimensional nano liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. J Proteome Res，2005，4(4)：1274-1286.

[7] Ana M ,Laura GG,Willy RG,et al. Derivatization of biomolecules for chemiluminesoent detection in capillary electrophoresis[J]. Analyt Technol Biomed Life Sci,2003 ,793 (1) :49- 74.

[8] 黃凌云,趙和平,丁勤學,等. 生物質譜在蛋白質組學研究中的應用[J]. 現(xiàn)代儀器, 2004, 1: 7-11.

[9] Volker Seibert, Matthias PA, Ebert thomas buschmann. Advances in clinical cancer p roteomics: SELDI-TOF-mass spectrometry and biomarker discovery[J]. Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 2005, 4 (1) : 16-26.

[10] Lucchi G, Hendra JB, Pecqueur D. Towards a standardization of the tools for the studies of clinical proteomics[J]. Med Sci ( Paris),2007,23 (1) :19-22.

[11] JT Shang S, Beretta L.Proteomics for the arly detection and treatment of hepatocellular carcinoma[J].Oncogene, 2006, 25: 3810-3817.

[12] Sun S, Yi X, Poon RT, et al. A protein-based set of reference markers for liver tissues and hepatocellular carcinoma[J]. BMC Cancer,2009,9:309.

[13] Codarin E, Renzone G, Poz A, et al. Differential proteomic analysis of subfractioned human hepatocellular carcinoma tissues[J]. Proteome,2009 ,8(5):2273-2284.

[14] Li N, Long Y, Fan X,et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma tissues[J]. Experimental & Clinical Cancer Research, 2009, 28:122.

[15] Lambert R.Diagnosis of esophagogastric tumors[J].Endoscopy,2004, 36: 110-119.

[16] Ryu JW，Kim HJ，Lee YS，et al．The proteomies approach to find biomarkers in gastric cancer[J]．J Korean Med Sci, 2003, l8(4):505-509．

[17] Mohri Y,Mohri T,Wei W,et al. Identification of macrophage migration inhibitory factor and human neutrophil peptides 1-3 as potential biomarkers for gastric cancer[J].Br J Cancer, 2009 ,101(2):295-302.

[18] Zhang J,Kang B,Tan X,et al. comparative analysis of the protein profiles from primary gastric tumors and their adjacent regions: MAWBP could be a new protein candidate involved in gastric cancer[J].Proteome Res, 2007,6(11):4423-4432.

[19] Cheng Wu, Zhiwen Luo, Xueyun Chen, et al．Two-dimensional differential in-gel electrophoresis for identification of gastric cancer-specific protein markers[J]．Oncology Reports, 2009, 21: 1429-1437.

[20] Xu SY, Liu Z, Ma WJ, et al. New potential biomarkers in the diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Biomarkers, 2009,14(5):340-346.

[21] Uemura N, Nakanishi Y, Kato H, et al. Transglutaminase 3 as a prognostic biomarker in esophageal cancer revealed by proteomics[J]. Cancer, 2009 ,124(9):2106-2115.

[22] Fu L, Qin YR, Xie D, et al. Identification of alpha-ctinin 4 and67 kDa laminin recepor as stage-pecific markers in esophageal cancer via proteomic approaches[J]. Cancer, 2007, 110 ( 12 ) :2672-2681.

[23] Nosho K, Yamamoto H, Takahashi T, et al. Genetic and epigenetic profiling in early colorectal tumors and prediction of invasive potential in p T1(early invasive) colorectal cancers[J]. Carcinogenesis,2007,28(6):1364.

[24] Kim YS, Hwang SY, Kang HY, et al. Functional p roteomics study reveals that N-Acetylglucosam inyltransferase V reinforces the invasive/metastatic potential of colon cancer through abenant glycosylation on tissue inhibitor of metalloproteinase-1[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(1):1-14.

[25] 盛新華, 高春芳, 王秀麗,等. 結直腸癌與其他惡性腫瘤血清低分子差異蛋白的比較[J]. 世界華人消化雜志, 2009, 17(9): 945-949.

[26] Jemal A，Murray T，Samuel A，et al. Cancer tatistics[J]. Cancer J Clin，2003，53(1)：5-26.

[27] Kaksaka T，Kondot T，Okano T，et al. Plasma proteomics of pancreatic cancer patients by multi-dimensional liquid chromatography and two-dimensional difference gelelectrophoresis (2D-DIGE)： up-regulation of leucine-rich alpha-2-glycoprotein in pancreatic cancer[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，852(1-2)：257-267.

[28] 金紅,狄揚,陳耀輝,等.正常組織和胰腺癌組織中差異表達蛋白的鑒定[J]. 高等學?；瘜W學報,2009,30: 302-307.