宋英君 王 霞 趙愛琳

(青島市立醫(yī)院婦科； 山東 青島 266000)

熒光原位雜交技術(fluorescent in situ hybridization， FISH)是分子細胞遺傳學技術的一項重要內(nèi)容[1],近十幾年來已從基礎醫(yī)學研究廣泛地轉向臨床醫(yī)學檢測領域。本文就熒光原位雜交技術(FISH)檢測子宮頸上皮細胞hTERC基因擴增的臨床應用做簡要綜述。

1 背 景

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，嚴重地危害婦女身體健康。 根據(jù)我國有關權威部門最新流行病學調(diào)查，子宮頸癌及癌前病變的患病率高達萬分之六十七，因此，進行早期的篩查和診斷尤為必要。

早期診斷是治療宮頸癌及提高患者預后的有效手段。國際上通用的篩查宮頸癌的方法一般為宮頸細胞涂片形態(tài)檢查及HPV病毒檢測。細胞涂片檢查敏感性一般在55%～80%左右，但一旦觀察到異常特異性可達到90%以上。但在分級鑒別中人為的因素大，客觀性和準確性不夠。HPV 檢測雖敏感性高，在84%～100%之間，但特異性一般只在64%～95%之間，并且90%的HPV陽性的病人在兩年之內(nèi)可轉陰，并不會導致宮頸癌的發(fā)生。因而從宮頸癌篩查及早期診斷角度出發(fā)，迫切需要其他可靠指標或手段來協(xié)助以上檢查，使結果更準確、可靠及更有預見性。

最近幾年，針對宮頸癌的研究表明，宮頸細胞由非典型性發(fā)育異常向宮頸癌轉變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴增，其中涉及到的最重要的基因可能是人類染色體末端酶(hTERC)基因[2-3]，擴增可阻止細胞的凋亡，因而可導致腫瘤的發(fā)生。因此，對hTERC基因擴增的檢測有助于宮頸癌的篩查及早期診斷[4-9]，F(xiàn)ISH技術為檢測這一基因擴增的標準方法。

2 原 理

熒光原位雜交 (fluorescent in situ hybridization FISH)技術是一種應用非放射性熒光物質依靠核酸雜交原理在細胞核中或染色體上顯示 DNA 序列位置的方法。FISH采用熒光標記的DNA探針，根據(jù)探針與被檢測標本中DNA序列的互補性，探針與樣本DNA雜交后，在熒光顯微鏡下檢測熒光信號而得出結果。FISH技術本身操作相對簡單，重復性好、穩(wěn)定，并具有很高的靈敏性及特異性。因此FISH非常適用于臨床醫(yī)學檢測。

2.1 FISH 技術的探針類型

FISH 技術是將標記的探針和待測序列雜交，根據(jù)雜交信號的有無及類型，達到診斷染色體病的目的[10-11]。 探針的種類按核酸性質不同又可分為 DNA、cDNA、cRNA 及合成寡核苷酸探針。用于雜交的探針包括5類：①染色體計數(shù)探針。主要指來自染色體著絲粒部位的特殊序列，如α衛(wèi)星 DNA 或染色體的特異片段 Y 染色體長臂的異染質區(qū)。②染色體位點特異探針。指針對某一染色體上單一 DNA 序列的探針， 例如診斷 Y 染色體性別決定區(qū)( sex determination region of Y chromosome，SRY) 基因的探針，可用來診斷染色體有無缺失、重復或診斷染色體微缺失綜合征。③全染色體涂抹探針(whole chromosome painting probes，WCP)這類探針特異地覆蓋特定的靶染色體，可用來診斷染色體的結構異常，如缺失、插入、易位等。④專門研究端粒的探針。其與著絲粒探針 WCP 聯(lián)合也用于檢測染色體易位等。⑤為特異患者制作特殊探針成功跨越斷裂點全長的探針，可用于篩查染色體臂間倒位及易位等。

2.2 FISH 技術的探針熒光標記方法

FISH 技術的探針熒光標記方法分為直接法及間接法。直接法用熒光素直接標記特殊的探針，經(jīng)變性、雜交、漂洗后，可直接在熒光顯微鏡下檢測染色體結構。 間接法則在雜交、漂洗之后，依抗原抗體反應的原理，既將熒光素與探針結合，又將熒光素與其特異的抗體結合，將待測信號放大，從而得以檢測特異的靶序列。間接法放大作用強，對單一序列診斷的敏感性較高。目前從單色 FISH 發(fā)展到雙色 FISH乃至多色 FISH，已經(jīng)可以用不同的熒光素以不同比例混合得到多種顏色的探針，診斷人類的多條染色體有無變異。

3 應 用

人類染色體端粒酶 RNA (hTERC)由 Feng等[12]于1995年首次從腎癌 293細胞系 cDNA文庫中篩選出。hTERC是合成端粒重復序列的模板,是端粒酶活性必需的核心組分之一。近年來研究顯示,宮頸細胞由非典型性發(fā)育異常向宮頸癌轉變過程中,幾乎均伴有3號染色體長臂擴增,其中所涉及最重要的基因可能為 hTERC基因。

Nakano[13]應用原位雜交法檢測宮頸不典型增生/化生、原位癌及浸潤癌等高增殖活性組織中 hTERC基因,發(fā)現(xiàn)均伴有 hTERC原位雜交信號局灶性高表達,提示 hTERC表達上調(diào)可能促使端粒酶激活,與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關。Wisman等[14]應用原位雜交及逆轉錄 —聚合酶鏈反應 (RT-PCR)方法檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變 (CIN) Ⅰ～Ⅲ級、宮頸癌和正常宮頸組織標本中 hTERC表達,結果幾乎所有標本都檢測出hTERC表達,未證明 hTERC與宮頸病變的關系。2003年,Heselmeyer等[15]首次將熒光原位雜交 (FISH)技術成功應用于宮頸細胞涂片檢測 3q26 hTERC基因。研究發(fā)現(xiàn),只有極少數(shù)正常、不典型增生 (ASC)和輕度上皮內(nèi)病變 (LSIL)標本檢測到 hTERC擴增,而 CIN Ⅱ中 hTERC擴增者占 63%,CINⅢ中占 76%,四倍體細胞數(shù)和 hTERC表達水平隨病變嚴重程度增加,認為 hTERC檢測可作為篩查高度上皮內(nèi)病變(HSIL)的獨立指標,有助于預測宮頸病變進展情況。2年后 ,Heselmeyer等[16]再次應用 FISH技術檢測 hTERC基因,標本取自隨訪 1～3 年中進展至 CINⅢ的 CINⅠ/CINⅡ者 (進展者 )、自愈的 CINⅠ/CINⅡ患者 (自愈者 )。結果發(fā)現(xiàn),所有進展者都伴有hTERC擴增,而自愈者無1例。值得注意的是,有 33%細胞學正常的標本檢測到 hTERC擴增,而這些患者歷經(jīng)短暫的潛伏期后被確診為 CINⅢ或浸潤癌。提示hTERC檢測可早期診斷宮頸癌,預測病變進展。FISH檢測可降低細胞學的假陰性率。

高危型 HPV感染已公認是宮頸癌發(fā)病的首要因素,Hopman等[17]研究了宮頸病變中, hTERC表達及 HPV整合情況的關系。其將 FISH探針應用于 CINⅡ/Ⅲ、微浸潤癌及浸潤癌標本,檢測 HPV病毒的物理狀態(tài)和 hTERC拷貝數(shù)。結果顯示,隨病變進展, hTERC拷貝數(shù)逐漸增加,而 hTERC擴增標本中,HPV也大部分被整合。從而認為宮頸 HPV感染與 hTERC擴增有關,高危型 HPV的基因整合和 hTERC擴增可能是宮頸 ASC向浸潤癌發(fā)展的重要因素 ,但尚未得出HPV感染導致 hTERC表達上調(diào),從而使癌發(fā)生的結論。 Andersson等[18]也報道h TERC 基因在子宮頸腺癌的擴增比例范圍為2.3～5.2， 平均比例為 3.3，hTERC 基因的檢測有助于子宮頸癌的早期篩查及診斷。

4 展 望

目前的研究已初步提示, hTERC基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定作用,但其具體機制尚不明確。hTERC對端粒酶活性至關重要,而端粒酶活性與宮頸癌發(fā)生密切相關,對抗 hTERC抑制端粒酶活性，有望成為宮頸癌治療的新手段。在宮頸癌潛伏期即可檢測到hTERC擴增,因而 hTERC檢測可用于宮頸癌早期診斷,且 hTERC擴增水平與腫瘤惡性程度呈正相關,可用于預測病情進展,并為選擇治療方法提供依據(jù),應用 FISH法對 hTERC進行定性、定量分析將具有重要意義。

[1] Levsky JM, Singer RH. Fluorescence in situ hybridization:past , present and future[J].J Cell Sci, 2003, 116: 2833 -2838.

[2] Munger K, Baldwin A, Edwards KM, et al. Mechanisms of human papilloma virus - induced oncogenesis[J].JVirol,2004, 78: 11451 - 11460.

[3] Sugita M, Tanaka N, Davidson S, et al. Molecular definition of a small amplification domain within 3q26 in tumors of cervix , ovary , and lung[J].Cancer Gen Cytogenet, 2000,117: 9 - 18.

[4] Heselmeyer K, Schrock E, Du Manoir S, et al. Gain of chromosome 3q defines the transitionfrom severe dysplasia toinvasive carcinoma of the uterine cervix[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 479 - 484.

[5] Heselmeyer K, Macville M, Schrk E, et al. Advanced -stage cervical carcinomas are defined by a recurrent pattern of chromosomal aberrations revealing high geneticinstability and a consistent gain of chromosome arm 3q[J].Genes Chromosomes Cancer, 1997, 19: 233 - 240.

[6] Kirchhoff M, Rose H, Petersen BL, et al. Comparative genomic hybridization reveals a recurrent pattern of chromosomal aberrations in severe dysplasia/carcinoma in sute of the cervix and in advanced - stage cervical carcinoma[J].Genes Chromosomes Cancer, 1999, 24: 144 - 150.

[7] Allen DG, White DJ, Hutchins AM, et al. Progressive ge-netic aberration detected by comparative genomic hybridiza-tion in squamous cell cervical cancer[J].Br J Cancer, 2000,83: 1659 - 1663.

[8] Yang YG, Shyong WY, Chang MS, et al. Frequent gain of copy number on the long arm of chromosome 3 in human cer-vical adenocarcinoma[J].Cancer Genet Cytogenet, 2001, 131:48 - 53.

[9] Huang FY, Kwok YKY, Lau ET, et al. Genetic abnor-malities and HPV status in cervical and vulvar squamous cell carcinomas[J].Cancer Genet Cytogenet, 2005, 157: 42 - 48.

[10] Sermon K, Van Steirteghem A, Liebaers I. Preimplantation genetic diagnosis[J].Lancet,2004,363 (9421):1633-1641.

[11] Nelson LJ. Preimplantation diagnosis[J].Clin Perinatol, 2003, 30(1) :67-80.

[12] FengJ, FunkWD,Wang SS, et al. TheRNA componentof human te-lomezase[J].Science,1995,269(5228):1236-1241.

[13] Nakano F. Malities and HPV status in cervical and vulvar squamous cell carcinomas[J].Cancer Genet Cytogenet, 2005, 157: 42 - 48.

[14] Wisman GB,De Jong S,Meersma GJ, et al. Telomerase in (pre) neoplasticcervicaldisease[J].HumPathol,2000,31(10):1304-1312.

[15] HeselmeyerHK,Janz V,Castle PE, et al,Detection of genomic amplification of the human telomerase gene (TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the diagnosisof cervical dysplasia[J].AmJ Pathol,2003,163(4):1405-1416.

[16] HeselmeyerHK, Sommerfeld K,White NM, et al. Genomic amplification of the human telomerase geng (TERC) in pap smears predictsthe developmentof cervical cancer[J].Am J Pathol,2005,166(4):1229-1238.

[17] Hopman AH, TheelenW,Hommelberg PP, et al. Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cer vical dysplasia to invasive cancer[J].J Pathol,2006,210(4): 412-419.

[18] Andersson S,Wallin KL, Hellstrem AC, et al. Frequent gain of thehuman telomerase gene TERC at 3q26 in cervical adenocarcinomas[J]. BrJ Cancer,2006,95(3):331-338