劉 偉 王學春

(泰山醫(yī)學院病理學教研室，山東 泰安 271000)

細胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡決定了多細胞生物體細胞數量，平衡的破壞可導致腫瘤的發(fā)生。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是抑制細胞凋亡的重要成分。Survivin和Livin作為IAP成員，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。近年來人們對其結構、分布、表達及其與腫瘤的關系做了大量的研究。CPP32(caspase-3)是凋亡執(zhí)行中的關鍵效應酶。本文對Survivin、Livin、CPP32蛋白與腫瘤相關性的研究進展綜述如下。

1 凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是高度保守的內源性抗凋亡基因家族的表達產物，腫瘤的發(fā)生與其過度表達具有密切的關系。IAP的抗凋亡作用主要通過抑制caspase的活化而達到凋亡抑制作用[1]，目前人類IAP已發(fā)現(xiàn)有8個成員，即NAIP，IAP(ILP-1/MIHA)，cIAP-1(HIAP-2/MI-HB)，cIAP-2(HIAP-1/MIHC)，survivin (TIAP)，apollon(Bruce)，ILP-2(Ts-IAP)和Livin(ML-IAP/KIAP)[2]。IAP主要有三個結構域：BIR、RING與CARD結構域[3]。①BIR結構域，即桿狀病毒IAP重復序列區(qū)(baculovirus IAP repeat， BIR)，位于N端，由含有2個或3個串聯(lián)的Cys/His的氨基酸殘基在內的約70個氨基酸組成，具有高度的保守性[4]。IAP蛋白一般包含1～3個BIR結構域，該結構域是IAP家族抑制細胞凋亡的功能區(qū)域。②RING結構域，是一個位于IAP COOH端的鋅指樣結構單元，它們存在于大多數IAP家族成員之中。③CARDs(Caspase srecruitment domains)結構域,位于IAPs分子的BIR區(qū)與鋅指結構之間的一系列序列。至今發(fā)現(xiàn)人類中僅cIAP1和cIAP2蛋白具有此結構，其功能尚不清楚。所有的IAP家族成員都包含BIR結構，所有的IAP家族成員都包含BIR結構，其余兩個結構并非必需[5]。

2 凋亡抑制基因Survivin、Livin

2.1 Survivin、Livin的結構和定位

Survivin是由Ambrosini等[6]于1997年發(fā)現(xiàn)，定位于人類染色體17q25,靠近端粒, 全長15 kb,含4個外顯子和3個內含子。Survivin的N端只含有一個保守的BIR結構域,無TATA啟動子和GC富集區(qū),其COOH端也無IAP家族特有的C端鋅指結構,而是有一個獨特的α-螺旋結構,富含疏水基團,能與紡錘體微管上的微管蛋白結合,作用于調節(jié)細胞周期的功能結構域,抑制細胞凋亡。

Livin是國外學者于2000年在人類基因組cDNA文庫中克隆得到，定位于染色體20q13, 全長為4.6kb，包含7個外顯子。Livin同樣含有IAPs家族成員特有的BIR和RING結構域。Livin BIR功能區(qū)是其發(fā)揮抗凋亡活性的必需結構，可與caspase結合。RING結構域不參與抑制細胞凋亡的作用，但對Livin在細胞內的合理分布及結構的穩(wěn)定具有重要的作用。

2.2 Survivin、Livin的分布與表達

Survivin的組織分布特征具有明顯的細胞選擇性，主要表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織,不見終末分化的成人組織(除胸腺和生殖腺外), 而在人類大多數腫瘤組織Survivin的表達特異性增高,且在不同細胞系中其表達量和亞細胞定位不同[7-8]，推測在腫瘤細胞和正常細胞中,Survivin存在的位置不同對細胞的增殖和凋亡作用機制有可能不同。

Livin在正常成人的大多數組織中(除胎盤外)均不表達,表皮、淋巴、脾臟和黑色素細胞表達很低,在胎兒發(fā)育過程中高表達,如胎兒的腦、胸腺和肝[9]。Livin在細胞中定位尚無統(tǒng)一結論，有學者[1,9-11]認為Livin主要表達于胞質。但Kasof等[9]認為Livin既在胞質內表達同時也表達于胞核。Vucic等[12]對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)Livin在細胞中主要表達于胞質。

2.3 Survivin、Livin的抗凋亡作用與機制

Survivin是目前已知作用最強的凋亡抑制蛋白，能以特征性的結構直接或間接抑制caspase依賴或caspase不依賴的凋亡途徑，有效地對抗細胞的凋亡過程。其機制主要有:①Survivin通過阻斷由Caspase-9介導、細胞色素C參與的細胞凋亡信號傳導即內源性凋亡途徑,間接抑制Caspase-3的活化,抑制細胞的凋亡；②抑制由Fas/Caspase-8誘導的Caspase活化和凋亡,即Survivin可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,使其不能有效地水解微管結構蛋白,維持了紡錘體的完整性,從而阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程；③Survivin可與輔助性線粒體源性caspase激活因子(second mitochondria-derived activator of caspase,SMAC)結合,進而抑制caspase活性；④Survivin通過非Caspase依賴細胞凋亡的途徑,如參與調節(jié)p53依賴的凋亡[13],干擾p53的功能進而抑制細胞凋亡；⑤Survivin還可通過對鈁錘體微管的作用調節(jié)細胞有絲分裂的過程, 通過促進姐妹染色單體精確分離和穩(wěn)定有絲分裂晚期微管結構而維持了紡錘體的完整性,間接促進了細胞的增殖,抑制細胞的凋亡[14]。

目前對Livin抗細胞凋亡的作用機制了解的并不多，Livin需通過一系列的凋亡刺激物的作用來表現(xiàn)凋亡的抑制，其抑制凋亡的機制主要有:①抗死亡受體介導的細胞凋亡作用，Vucic等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Livin對Fas，TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1)，DR4(death receptor 4)及DR5(death receptor 5)介導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用。在Fas/caspase-8誘導的死亡受體途徑中，Livin不直接結合caspase-8，而是直接抑制核心蛋白酶caspase-3，從而抑制整條途徑發(fā)揮抗凋亡途徑[15]；②抗線粒體介導的細胞凋亡作用，Livin可與介導細胞凋亡的下游效應caspase,即激活形式的caspase-3,7,9結合，使級聯(lián)反應中的caspase間的相互作用和核酸的裂解受到抑制，從而導致腫瘤細胞的無限增殖[16]；③抗化療藥物介導的細胞凋亡作用，研究發(fā)現(xiàn)，轉染Livin基因的MCF7細胞可有效對抗阿霉素、4-TBP(4-tertiary butylphenol)誘導的細胞凋亡[9]。

2.4 Survivin、Livin與腫瘤

2.4.1Survivin、Livin在腫瘤中的表達

凋亡抑制是腫瘤細胞的一個普遍特性，Survivin和Livin作為IAP家族的成員正日益受到人們的關注。腫瘤細胞中凋亡抑制基因的高表達能明顯抑制細胞凋亡,逃避機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和清除[17]。大量研究表明，Survivin 和Livin在人類多種類型的腫瘤細胞中高表達。王小娟等[18]采用免疫組化SP檢測發(fā)現(xiàn)Survivin在胃癌組織中的陽性表達率為80%；秦建偉等[19]采用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Survivin陽性表達率為87.2%，癌旁組織為46.2%；李美玲等[20]采用免疫組化SP檢測發(fā)現(xiàn)，乳癌組Survivin的陽性表達率為67.9 %；在對MCF-7乳腺癌細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，Livin羥基末端的RING結構與細胞內微絲結構結合，從而定位在細胞骨架，使Livin BIR功能區(qū)能夠有效地抑制Fas、TNFR1、DR4、DR5引起的細胞凋亡，導致乳腺癌的發(fā)生[10]；周晟等[21]采用RT-PCR和免疫組化的方法證實，Livin mRNA和蛋白在乳腺癌腫瘤組織中含量顯著高于癌旁非腫瘤組織。

2.4.2Survivin、Livin與腫瘤的治療

目前針對腫瘤的治療，除了傳統(tǒng)的手術治療、放療和化療外，腫瘤的綜合治療特別是基因治療和免疫治療為腫瘤的治療提供了新途徑，能夠增加對凋亡的抵抗是腫瘤細胞的一個特點。在腫瘤的治療中如何抑制特殊的抗凋亡因子的作用將會給我們提供一個合理的新的治療策略。進一步的體外實驗證明，在多種腫瘤中IAP的過表達與化療耐藥有關，認為化療中如果藥物能夠干預IAP將會起到更好的療效[22]。

在基因治療方面，RNA干擾技術和反義核苷酸技術被用來干擾Survivin 和Livin的基因表達，用于增加腫瘤細胞凋亡的易感性。用Survivin反義核苷酸轉染的肺癌細胞, Survivin mRNA和蛋白表達量降低，呈劑量依賴性和時間依賴性[23]，細胞生長受限及凋亡指數增加；Crnkovic等[24]使用具有靶向作用的小干涉型RNA(siRNA)干涉腫瘤細胞內生性Livin基因的表達，使Livin基因沉默而不表達蛋白，腫瘤細胞在使用阿霉素、紫外線照射以及TNF-α等凋亡促進劑治療后，凋亡率大大增加。由此推論，Survivin 和Livin基因可能成為腫瘤治療上有前途的分子靶點。

在免疫治療方面，Xiang等[25]構建了Survivin的DNA口服疫苗，用于肺癌小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)其可誘導出高度活性樹突狀細胞(DC),產生有效的特異性CD8+T細胞免疫反應，對抗體內Survivin抗原,抑制新生血管的生成和誘導腫瘤細胞凋亡,消除或抑制小鼠體內腫瘤的轉移；Mads等[26]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中，腫瘤細胞表達的Livin作為一種腫瘤抗原物質，在外周血中會產生特異性地識別Livin的抗體，在浸潤于腫瘤中針對Livin的反應性T細胞表面包被HLA-A24(human leucocyte antigen-A24)抗原復合體，它對黑色素瘤細胞具有細胞毒作用，因此預示Livin可作為免疫干涉的適當靶點。

3 凋亡調控基因Survivin、Livin與CPP32

3.1 CPP32基因

哺乳動物的細胞凋亡由天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族介導[27]。研究[28]表明，多種基因參與細胞凋亡的調控，而caspase蛋白的表達是各種細胞凋亡機制的最后共同通路。CPP32,又稱半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32，caspase-3)，是caspase家族中與凋亡關系最密切的成員，大多數觸發(fā)細胞凋亡的因素最終均需通過CPP32介導的信號轉導途徑導致細胞凋亡。Neill等[29]發(fā)現(xiàn)，在良性前列腺增生中CPP32表達明顯高于前列腺惡性腫瘤，并且存在著自發(fā)凋亡，從而推論CPP32作為凋亡的核心成分之一在腫瘤的自發(fā)凋亡中發(fā)揮著重要的作用。可見，CPP32在腫瘤中的表達具有重要的意義。

3.2 Survivin、Livin與CPP32的關系

在腫瘤細胞中Survivin和Livin基因均與CPP32基因協(xié)同發(fā)揮調節(jié)細胞凋亡的作用。推測其機制如下：(1)Survivin通過阻斷由Caspase-9介導、細胞色素C參與的細胞凋亡信號傳導即內源性凋亡途徑,間接抑制Caspase-3的活化,抑制細胞的凋亡；(2) Survivin抑制由Fas/Caspase-8誘導的Caspase活化和凋亡,即Survivin可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,使其不能有效地水解微管結構蛋白,維持了紡錘體的完整性,從而阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程；(3)Livin主要通過抑制凋亡終末效應酶caspase的活性發(fā)揮其抑制細胞凋亡的作用[11]。Livin能夠直接抑制caspase-3,7,9的水解作用，其BIR結構域能夠和caspase結合并抑制caspase的功能。Livin還能夠在凋亡起始點直接干擾Procaspase-9或caspase-9的活性，削弱caspase的活化，抑制細胞凋亡發(fā)生。

Survivin基因、Livin基因、CPP32基因均為凋亡相關基因，Survivin基因和Livin基因抑制細胞凋亡的發(fā)生，而CPP32則可誘導凋亡。這些基因的異常表達或突變影響到凋亡的發(fā)生，從而可使惡性變的細胞繼續(xù)存活，為細胞的DNA進一步損傷或突變提供條件。

4 展 望

腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致，受體內外多重因素調控。目前腫瘤治療兩個最大的問題為放化療對正常細胞具有毒性作用和腫瘤細胞對藥物產生抗性。誘導癌細胞凋亡的腫瘤基因治療是提高治療效果的一條重要的途徑。Survivin和Livin作為IAP家族成員，其確切的抗細胞凋亡作用已得到證實。因此，研究Survivin和Livin的作用機制可以為掌握腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預后提供重要的理論依據，Survivin和Livin有望成為腫瘤的標志物，可能成為腫瘤治療的新靶點，為腫瘤的診斷治療開辟一條新途徑。但是目前對Survivin和Livin的研究僅僅停留在實驗階段，且大都是體外實驗，還有待進一步的臨床實驗來證實。相信對Survivin和Livin的更深入的研究能夠為腫瘤的治療提供行之有效的新途徑。

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