程永波綜述 房殿春 易 濱審校

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)反映的主要是基因型和表型的關(guān)系。研究范圍包括:DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、遺傳印記、X染色體失活、RNA調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件、副突變、位置效應(yīng)斑、等位反式互補(bǔ)等[1～5]。近年來研究較多的是胞嘧啶 DNA甲基化、RNA干擾(RNAi)調(diào)控、組蛋白修飾 3種,尤其是 DNA甲基化。2003年歐洲 HEC宣布實(shí)施人類表觀基因組計(jì)劃(HEP),以指導(dǎo)和系統(tǒng)地研究 DNA基因甲基化在人類表觀遺傳、胚胎發(fā)育、基因印記、等位基因失活及腫瘤發(fā)生中的作用[6]。本文就現(xiàn)階段對(duì)DNA甲基化研究的基本現(xiàn)狀作一概述,以獲得 1個(gè)整體認(rèn)識(shí),從而在此基礎(chǔ)上對(duì)其作進(jìn)一步研究。

1 CpG島

DNA甲基化多發(fā)生于 DNA鏈上胞嘧啶第 5位碳原子,其與甲基共價(jià)結(jié)合,胞嘧啶由此被修飾為 5甲基胞嘧啶(5mC),哺乳動(dòng)物基因組中 5 mC占胞嘧啶總量的 2% ～7%,70%～90%的 5mC存在于CG二聯(lián)核苷。CG在DNA中呈回文結(jié)構(gòu),通常稱為 CpG(p表示磷酸基),中文為磷酸胞苷酰[7]。哺乳動(dòng)物中,CpG序列在基因組中出現(xiàn)的頻率僅有 1%,遠(yuǎn)低于基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區(qū)域中,CpG序列密度很高,可以達(dá)均值的 5倍以上,成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū),形成所謂的 CpG島。CpG島大小說法不一,但范圍在 0.5～2 kb之間,通常大約為 500多個(gè)堿基,CG含量超過 55%。其主要特征為:主要位于基因啟動(dòng)子區(qū),少數(shù)位于第一外顯子區(qū);在所有正常組織中通常是非甲基化的,看家基因的啟動(dòng)子都含有CpG島,且都是非甲基化的,組織特異性基因缺乏這樣的結(jié)構(gòu);一旦受相關(guān)因素影響發(fā)生甲基化可直接導(dǎo)致相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)基因沉默,而基因下游即非島區(qū) CpG甲基化則不抑制基因的轉(zhuǎn)錄;啟動(dòng)子區(qū) CpG甲基化的密度與轉(zhuǎn)錄的抑制程度相關(guān),CpG甲基化的密度增加轉(zhuǎn)錄會(huì)被完全抑制[8]。正是由于上述特征,DNA甲基化的研究多集中在啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。

2 DNA甲基化分類及甲基化酶

DNA甲基化分維持甲基化和從頭甲基化(又稱構(gòu)建性甲基化)。前者是在甲基化DNA半保留復(fù)制出的新生鏈相應(yīng)位置上進(jìn)行甲基化修飾的過程,新生鏈只在與母鏈甲基化位置相同的堿基處發(fā)生甲基化;后者是在原來沒有甲基化的DNA雙鏈上進(jìn)行甲基化的過程,原本甲基化全去甲基化后又重新甲基化也屬此類。不管是維持甲基化還是從頭甲基化,在將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)提供甲基添加到DNA分子中的過程中,都需要 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的參與。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 3種。DNMT1功能是 DNA復(fù)制維持甲基化[9],分子量約 193500,含有具催化作用的 C端和結(jié)合與調(diào)節(jié)功能的N端,定位于 19p 13.3-p13.2,其缺失將導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常及死亡。DNMT3a和DNMT3b功能主要是從頭甲基化,兩者起協(xié)同作用。DNMT3a定位于 2p23,DNMT3b定位于 20q11.2,這兩種酶催化在發(fā)育過程中去甲基化的 CpG位點(diǎn)從頭甲基化。兩者的基因變異可影響正常發(fā)育。DNMTs活性增加可使DNA發(fā)生異常甲基化、基因活性改變和染色體不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明,DNMTs在增生細(xì)胞里的水平高于靜默細(xì)胞,瘤細(xì)胞里的DNMTs表達(dá)更高且有提高惡性細(xì)胞對(duì)周圍組織侵襲的能力[10]。

在癌細(xì)胞中,DNMT基因表達(dá)增高往往先于高甲基化變化,因此可以認(rèn)為DNMT活性增高是癌細(xì)胞的1個(gè)具有特征性的早期分子改變。DNMTs正因?yàn)榕c腫瘤發(fā)生發(fā)展的這種相關(guān)性,所以成為目前DNA去甲基化恢復(fù)抑癌基因功能的熱點(diǎn)靶向分子。

DNA去甲基化酶有兩種類型:位點(diǎn)特異性和總基因組 DNA去甲基化酶,目前對(duì)它們的了解甚淺。

3 DNA甲基化模式

DNA甲基化在不同組織具有不同模式。脊椎動(dòng)物正常組織基因的甲基化狀態(tài)有 3種:持續(xù)的低甲基化狀態(tài),如管家基因;去甲基化狀態(tài),如發(fā)育階段中的一些基因;高度甲基化狀態(tài),如女性的一條失活的 X染色體。在腫瘤組織中的模式是普遍的低甲基化和高甲基化并存,即基因組廣泛低甲基化和局部CpG島的高甲基化,這種變化可在同一腫瘤中同時(shí)發(fā)生,總體來說甲基化水平是降低的,目前尚不清楚這種現(xiàn)象是同一作用機(jī)制產(chǎn)生的共同結(jié)果還是來源于腫瘤發(fā)生過程中的不同機(jī)制。腫瘤組織的上述兩種甲基化均發(fā)生于惡變的前期,提示基因組范圍DNA低甲基化和局部CpG島高甲基化是癌變過程中早期的分子異常之一[11～13],并在腫瘤發(fā)生過程中有著重要作用。

4 DNA甲基化的作用

DNA甲基化的功能仍不完全清楚,到目前為止比較確定的作用是調(diào)控基因表達(dá)、促進(jìn)基因突變,這是機(jī)體正常發(fā)育、X 2染色質(zhì)失活、基因組印跡等所必不可少的。近期研究表明DNA甲基化在DNA修復(fù)、基因不穩(wěn)定性等方面也發(fā)揮潛在作用,并且發(fā)現(xiàn)其可以進(jìn)化為 1種防御機(jī)制,抑制“寄生”DNA序列(如逆轉(zhuǎn)錄病毒片段)的侵入[14]。

4.1 DNA甲基化與基因表達(dá)

DNA甲基化在基因表達(dá)上的調(diào)控作用已經(jīng)公認(rèn),其最終結(jié)果是導(dǎo)致基因的失活,即基因沉默。這種調(diào)控作用從本質(zhì)上說是 1種DNA水平的調(diào)控,從效果上是直接影響基因的轉(zhuǎn)錄。在真核生物中,甲基化和非甲基化基因的轉(zhuǎn)錄活性相差可達(dá) 106倍。這種轉(zhuǎn)錄抑制機(jī)制主要有以下 4點(diǎn):①DNA甲基化直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子和各種啟動(dòng)子識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合:DNA甲基化后會(huì)引起 DNA分子構(gòu)象的改變從而影響特定蛋白質(zhì)及其黏附能力而直接干擾兩者的結(jié)合;5-甲基胞嘧啶和鳥嘌呤的解鏈溫度比未進(jìn)行過甲基化修飾的胞嘧啶和鳥嘌呤堿基對(duì)的解鏈溫度高,影響解鏈;甲基化修飾改變了 DNA自身的三級(jí)結(jié)構(gòu),影響了其它序列 RNA酶的直接作用。②甲基化的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子引起基因沉默:CpG島引起基因沉默的最好的例證是基因組印記和女性 X染色體的失活。③通過影響核小體的位置或與其它染色體蛋白質(zhì)相互作用而改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu),介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。有學(xué)者發(fā)現(xiàn) DNA甲基化后與組蛋白結(jié)合得更緊,核小體結(jié)構(gòu)更緊密,并且 75%的甲基化 CpG結(jié)合在核小體核心上,僅少量分布在核小體間的連接區(qū),而活躍基因的敏感區(qū)是低甲基化的。④MeCP2的作用。1989年有學(xué)者發(fā)現(xiàn) 1種活性物質(zhì)與甲基化的 DNA有特異親和力,命名為 MeCP1和 MeCP2。后者是第 1個(gè)真正能選擇性識(shí)別甲基化CpG的蛋白質(zhì)家族成員,是由 1條單鏈多肽組成的染色體相關(guān)核蛋白,與甲基化 DNA結(jié)合所需要的最小區(qū)域命名為甲基-CpG-結(jié)合域(methyl-CpG-binding domain,MBD),可選擇性結(jié)合甲基化 DNA。MBD的 1個(gè)重要功能是抑制轉(zhuǎn)錄,可在體內(nèi)外與甲基化的基因啟動(dòng)子結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄[15],對(duì)于非甲基化的啟動(dòng)子則不能抑制其轉(zhuǎn)錄。與MeCP1不同,MeCP2僅能結(jié)合包含 1個(gè) CpG對(duì)的 DNA,而 MeCP1則只能結(jié)合高密度甲基化的DNA[16]。

對(duì)于 DNA甲基化可以引起基因沉默也有不同的觀點(diǎn),有學(xué)者認(rèn)為 DNA甲基化可能不是基因沉默的原因,而是結(jié)果。從時(shí)間上看往往是先基因沉默,然后才出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象,甲基化只是用來標(biāo)識(shí)沉默基因的,并同時(shí)向結(jié)合蛋白給出信號(hào),防止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合,協(xié)同抑制基因表達(dá)。

4.2 DNA甲基化與基因突變

DNA甲基化可以促進(jìn)基因突變,因?yàn)?5′甲基胞嘧啶可自發(fā)或在 S-腺苷蛋氨酸的作用下引起鄰位脫氨而變?yōu)樾叵汆奏?導(dǎo)致 G/T錯(cuò)配,如果未修復(fù)即為 G—T點(diǎn)突變。這是最常見的突變,在抑癌基因p53中也最常見,可以認(rèn)為是腫瘤相關(guān)基因甲基化促進(jìn)細(xì)胞惡變的 1種機(jī)制[17]。

5 DNA甲基化與其它表觀遺傳修飾和環(huán)境的關(guān)系

DNA甲基化與其它表觀遺傳修飾之間存在密不可分的關(guān)系,與外界環(huán)境也存在千絲萬縷的因果聯(lián)系。

5.1 DNA甲基化與其它表觀遺傳修飾之間的關(guān)系

DNA甲基化與組蛋白的修飾和染色質(zhì)的重塑可以看作是 1個(gè)整體,共同對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用。近來有不少學(xué)者已經(jīng)將DNA甲基化和組蛋白去乙酰基作用兩種機(jī)制聯(lián)系起來進(jìn)行研究,目前已證實(shí) DNA甲基化與組蛋白去乙?；收嚓P(guān),而在通常情況下含有 CpG島的染色質(zhì)一般被高度乙?；?缺乏組蛋白 H 1,包含 1個(gè)無核小體區(qū)域[18～21]。

5.2 DNA甲基化與DNA損傷的關(guān)系

DNA甲基化與 DNA損傷有關(guān),后者可引起低甲基化。烷化劑可以誘發(fā)各種細(xì)胞的 DNA損傷,在這種應(yīng)急狀態(tài)下,細(xì)胞可通過多種途徑降低細(xì)胞 DNMT1水平,從而導(dǎo)致全基因組低甲基化。低甲基化有可能是細(xì)胞對(duì)DNA損傷的即時(shí)適應(yīng)反應(yīng),同時(shí)也是細(xì)胞癌變啟動(dòng)階段的早期現(xiàn)象[22]。細(xì)胞癌變有可能是正常細(xì)胞在遭受非致死性DNA損傷等打擊條件下,其原始的被抑制的SOS應(yīng)急機(jī)制被激活,基因組低甲基化則是這種應(yīng)急反應(yīng)的組成部分。這種低甲基化可能有利于啟動(dòng)細(xì)胞潛在的容錯(cuò)機(jī)制,甚至是恢復(fù)細(xì)胞潛在的增殖能力。這些反應(yīng)使得細(xì)胞免于凋亡而呈 1種類胚胎化過程[23]。

有些致癌物并不損傷DNA而導(dǎo)致去甲基化,如砷可誘發(fā)cmyc基因低甲基化而使其表達(dá)上調(diào)。砷在代謝過程中需要高度甲基化,其甲基供體同樣是 SAM,由于競爭而使基因組整體甲基化水平低下。

5.3 DNA甲基化與膳食因素的關(guān)系

膳食因素對(duì)DNA甲基化有各種不同的復(fù)雜影響,如葉酸、維生素B12等[24,25]。人體所有的甲基化反應(yīng)所需甲基基團(tuán)均來自食物中的甲基供體或攜帶一碳單位的代謝組分,如甲硫氨酸、甲基葉酸、氯化膽堿,三者在體內(nèi)的代謝相互依存。葉酸是一碳單位代謝過程中的中心角色,其經(jīng)過多級(jí)還原反應(yīng),最后形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),SAM將其甲基基團(tuán)提供給細(xì)胞中 80多個(gè)生物甲基化反應(yīng)。葉酸缺乏引起的 DNA甲基化改變相當(dāng)復(fù)雜,其根據(jù)細(xì)胞類型、靶器官、細(xì)胞轉(zhuǎn)化所處的不同階段、個(gè)體遺傳背景發(fā)生變異,同時(shí)還表現(xiàn)基因和DNA位點(diǎn)的特異性,這可能與DNA損傷引起DNMT1變化特性有一定聯(lián)系。通常情況下,葉酸缺乏在引起 DNA鏈損傷、異常堿基摻入、基因組整體甲基化水平下降的同時(shí)伴有DNMT1活性的提高和局部CPG島的超甲基化。過度攝入葉酸和SAM的前體甲硫氨酸時(shí)有可能引起CpG島的超甲基化和看家基因的沉默。

維生素 B12對(duì)DNA甲基化也有影響,在血液中的主要形式是甲基鈷氨素(MeCb1),甲基鈷氨素有可能是除SAM的第二途徑的甲基基團(tuán)提供者。

6 DNA甲基化的臨床意義及檢測

基因啟動(dòng)子異常甲基化在許多腫瘤發(fā)生過程中是 1個(gè)頻發(fā)的早期事件,因此可以作為癌癥預(yù)防、早期檢測、療效預(yù)測、抗癌劑篩選等分子生物標(biāo)志,其中癌變細(xì)胞可以釋放DNA到外周血中,因此可以用外周血為樣品檢測相關(guān)基因的啟動(dòng)子異常甲基化,為腫瘤的早期診斷提供有價(jià)值的信息[26～28]。

經(jīng)過幾十年的研究,DNA甲基化檢測方法和分析手段不斷進(jìn)步,不斷成熟,并且日趨簡單快捷,到目前為止至少已報(bào)道了三類十多種此類方法。主要的有甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法、基因組直接測序法、基于重亞硫酸鹽處理基礎(chǔ)上的測序、甲基化特異性 PCR(MSP)、限制性分析(COBRA)、甲基化敏感單核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、PCR-RFLP、Bips等方法、甲基化敏感的單鏈構(gòu)象分析法(MS-SSCA),與基因蕊片相結(jié)合的快速大通量分析法等[29～32],不同的方法各有利弊,已有多位學(xué)者對(duì)此領(lǐng)域的研究進(jìn)展做了詳細(xì)總結(jié),在此不再贅述。

綜上所述,DNA甲基化是 1種高于基因組序列水平的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,是在表觀基因組水平精確研究正常和疾病組織DNA甲基化模式的特征和差異,揭示如腫瘤等疾病的表觀遺傳學(xué)機(jī)制,并將DNA甲基化模式的改變與基因沉默、年齡相關(guān)變化和疾病特異性改變聯(lián)系在一起,是 1個(gè)很有前景的研究領(lǐng)域。經(jīng)過六十多年的研究發(fā)展,對(duì) DNA甲基化的模式、作用等已有了相對(duì)深入的認(rèn)識(shí),但目前對(duì)甲基化與去甲基化的分子機(jī)制、正常甲基化與去甲基化平衡如何維持等等問題仍沒有完全研究清楚,這也許是以后需要進(jìn)一步努力的方向。

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