張文英 陳紹莉

（遼寧省農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)校 110161）

雜種優(yōu)勢(shì)育種已成為許多蔬菜的主要育種方法。其中，選育雄性不育系及其恢復(fù)系是關(guān)鍵。通過基因工程的手段創(chuàng)造雄性不育系和恢復(fù)系可以克服常規(guī)育種手段的局限性，較之利用自然變異、遠(yuǎn)緣雜交和引種等選育手段具有更廣闊的前景。近幾年，我國在番茄、大白菜、甘藍(lán)等蔬菜上利用基因手段獲得雄性不育系方面的研究取得了較大進(jìn)展。

1 基因工程雄性不育的機(jī)制

1.1 花粉發(fā)育的分子生物學(xué)研究

從植物發(fā)育分子生物學(xué)的角度來看，植物發(fā)育的各個(gè)階段是植物基因工程時(shí)空調(diào)控表達(dá)的結(jié)果。在花粉發(fā)育過程中，減數(shù)分裂后或者小孢子有絲分裂后有大量的基因被激活，例如：番茄中的Lat 51和Lat 52等，這些花粉特異基因的啟動(dòng)子可以應(yīng)用在雄性不育基因工程中，從而達(dá)到雄性不育和恢復(fù)可育的目的。除了花粉特異基因外，絨氈層特異表達(dá)基因也備受重視。目前，絨氈層特異的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)及其特異的遺傳序列方面的探討取得了初步進(jìn)展，并且已經(jīng)從不同植物中分離出一些絨氈層特異基因的cDNA 克隆，如番茄中的 108，127a，92b，油菜 A9 部分在花藥和花粉中特異表達(dá)。

1.2 花藥或花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆

轉(zhuǎn)基因雄性不育及其恢復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵是花藥或花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子，花藥或花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子可以直接驅(qū)動(dòng)人工雄性不育基因在花粉或花藥內(nèi)特異表達(dá)，而對(duì)雌蕊和其它器官?zèng)]有影響。目前已先后分離克隆和測(cè)序了 TA29、ZM13、A9、S1、Wosg6B等花藥或花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)時(shí)空的分析，為創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因雄性不育奠定了基礎(chǔ)。

2 基因工程雄性不育的方法

2.1 借助編碼細(xì)胞毒素基因的特異表達(dá)

將花粉或花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子、細(xì)胞毒素基因以及轉(zhuǎn)錄終止子3部分組裝構(gòu)建成嵌合基因并轉(zhuǎn)化，細(xì)胞毒素的特異表達(dá)能夠選擇性的破壞與花粉發(fā)育相關(guān)的某些器官或組織，阻斷其發(fā)育過程，導(dǎo)致植物雄性不育。

Mariani等把TA29與Barnase基因相連，構(gòu)建了嵌合基因TA292Barnase，以農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化到煙草和油菜，得到了轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Barnase基因在絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)，專一性的破壞絨氈層的發(fā)育，導(dǎo)致花粉敗育，而除了花粉敗育外，轉(zhuǎn)基因植株在其它方面都是正常的。目前，利用基因工程創(chuàng)造雄性不育主要采用上述方法。B lock等利用玉米的絨氈層特異啟動(dòng)子pca55和水稻的絨氈層特異啟動(dòng)子pE1和pT72與Barnase基因嵌合后轉(zhuǎn)化小麥獲得雄性不育植株。有人將一個(gè)編碼核糖體失活蛋白 （RIP）的cDNA序列置于TA29啟動(dòng)子控制之下導(dǎo)入煙草，在21株轉(zhuǎn)化株中20株表現(xiàn)雄性不育。我國學(xué)者在這方面也取得了很大進(jìn)展。李勝國等通過融合TA29和Barnase以及TA29和Barstar構(gòu)建了人工雄性不育基因和恢復(fù)基因，轉(zhuǎn)化煙草后獲得了雄性不育植株。Zhan等利用水稻花粉啟動(dòng)子psl和Barnase基因，轉(zhuǎn)化在煙草中獲得了雄性不育植株。凌定厚利用psl2Barnase載體獲得了水稻的轉(zhuǎn)基因雄性不育植株。周雪榮等將構(gòu)建好的嵌合基因TA292barnase轉(zhuǎn)化油菜，得到的轉(zhuǎn)化株是完全雄性不育的，對(duì)花藥進(jìn)行組織切片分析，證明轉(zhuǎn)化的barnase基因破壞了絨氈層細(xì)胞，最終導(dǎo)致花粉發(fā)育不良和雄性不育。鐘蓉、羅玉英等和彭仁旺分別將TA292Barnase雄性不育基因?qū)敫仕{(lán)型油菜和煙草中，轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)為雄蕊退化，花絲短于柱頭，花粉萌發(fā)率極低。劉大文等利用玉米花粉啟動(dòng)子Zm13和Barnase基因構(gòu)建了雄性不育基因，并用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米，獲得了結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因植株。目前，已有大量的植物花粉花藥基因的特異啟動(dòng)子被鑒定和測(cè)序，它們與任何細(xì)胞毒素基因相連均可以培養(yǎng)工程不育株。不過，從目前來看，Barnase基因仍是用于培育基因工程雄性不育的最佳細(xì)胞毒素基因。

2.2 利用反義RNA技術(shù)

通過反義RNA技術(shù)阻斷與花粉發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)同樣可以獲得雄性不育株。類黃酮是花粉發(fā)育過程中的重要物質(zhì)，苯基乙烯酮（CHS）是其合成的關(guān)鍵酶。

VanderMeer將花藥盒序列與CaMV35S啟動(dòng)子串聯(lián)，使其在花藥中表達(dá)，然后將CHS基因的反義RNA基因與之串聯(lián)構(gòu)建成嵌合基因?qū)氚珷颗＃瑢?shí)現(xiàn)了CHS反義RNA基因在矮牽?；ㄋ幗q氈層中的表達(dá)，抑制了CHS的合成，阻礙了花粉的發(fā)育，得到了雄性不育的矮牽牛植株。Kitashiba等將反義alter-native oxidase與TA29相連構(gòu)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，造成轉(zhuǎn)基因煙草部分花粉敗育。Schoenbeck等將反義NADH2GOGAT基因與AAT22啟動(dòng)子構(gòu)建成嵌合基因轉(zhuǎn)化到苜蓿，發(fā)現(xiàn)在苜蓿根瘤和花中的NADH谷氨酸合成活性下降，最終得到了雄性不育的轉(zhuǎn)基因苜蓿。我國學(xué)者利用此技術(shù)成功的創(chuàng)造了番茄、煙草等轉(zhuǎn)基因雄性不育植株。李艷紅等構(gòu)建了反義肌動(dòng)蛋白基因和花藥特異啟動(dòng)子TA29組成的嵌合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法途徑將該基因轉(zhuǎn)化到小麥中，有60%的轉(zhuǎn)化株為完全雄性不育，在煙草和番茄中也得到了類似的結(jié)果。李祥等利用TA29啟動(dòng)子與HSP70反義cDNA構(gòu)建融合基因并轉(zhuǎn)化到煙草中，創(chuàng)造了雄性不育植株。

2.3 提早降解胼胝質(zhì)

在花粉發(fā)育過程中，小孢子的分離要靠花藥絨氈層分泌胼胝質(zhì)酶降解堅(jiān)硬的胼胝質(zhì)。這個(gè)過程有著嚴(yán)格的時(shí)間性，如果提前分泌胼胝質(zhì)酶，過早降解胼胝質(zhì)，小孢子發(fā)育就會(huì)停止，產(chǎn)生畸形花粉粒，導(dǎo)致植物雄性不育。

Worrall等將經(jīng)過修飾的B21，32葡聚糖酶基因與擬南芥絨氈層特異表達(dá)的啟動(dòng)子A3和A9重組，使轉(zhuǎn)基因植株在減數(shù)分裂時(shí)期表達(dá)過量的B21，32葡聚糖酶，從而出現(xiàn)了不同程度的雄性不育現(xiàn)象。Tsuchiya等把從大豆中分離出來的B21,32葡聚糖和從水稻中分離出來的Osg6B啟動(dòng)子構(gòu)建成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株大多數(shù)花粉缺乏萌發(fā)孔，花粉集聚，花粉粒上附著胼胝，四分體時(shí)的花粉缺乏細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致在四分體開始階段胼胝質(zhì)降解，進(jìn)而形成不同程度的雄性不育。

2.4 利用線粒體相關(guān)基因

在高等植物中存在的胞質(zhì)雄性不育與線粒體的顯性突變有關(guān)，即線粒體機(jī)能損傷會(huì)導(dǎo)致花粉敗育。其中，RNA編輯與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有密切的關(guān)系。

Hernould等在小麥的雜合細(xì)胞質(zhì)不育系中發(fā)現(xiàn)Atp9轉(zhuǎn)錄物的編輯率比可育親本的編輯率低。這可能是RNA的非正常編輯影響ATP的合成，從而降低花粉形成所需要的ATP水平，導(dǎo)致雄性不育。他們利用來自小麥的非編輯的Atp9線粒體基因誘導(dǎo)，獲得了雄性不育轉(zhuǎn)基因植株。Zabaleta等通過表達(dá)Atp9的反義RNA，將由非編輯的Atp9基因誘導(dǎo)的雄性不育轉(zhuǎn)基因植物恢復(fù)為雄性可育的植物。由于非編輯的Atp9的轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，使花器官正常發(fā)育并產(chǎn)生種子，這也說明非編輯的Atp9基因表達(dá)可以誘導(dǎo)雄性不育，并可通過反義技術(shù)使其恢復(fù)育性。Hernould等在Atp9基因或其cDNA前，分別連接上酵母的輸導(dǎo)肽編碼區(qū)后，插入含CaMV35S啟動(dòng)子和CaMV基因工程終止子的雙元表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化煙草，在獲得的轉(zhuǎn)Atp9基因植株中出現(xiàn)半不育、全不育等類型的雄性不育株。He等將來自大豆的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體DNA序列ORF239轉(zhuǎn)入煙草核基因組中，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)為半不育或雄性不育。易平等首次證明HL型細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體Atp6轉(zhuǎn)錄本的編輯有一定的相關(guān)性，編輯不充分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最終會(huì)干擾線粒體功能的正常發(fā)揮。

2.5 導(dǎo)入與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的基因

許多研究者發(fā)現(xiàn)不育與可育胞質(zhì)線粒體不同。一些不育細(xì)胞質(zhì)特有的質(zhì)粒往往被認(rèn)為與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)，如：水稻紅蓮型不育系中的m3和orfH79等。把這些質(zhì)粒分離出來，將其中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的片段重新構(gòu)建新的嵌合基因，再導(dǎo)入可育的植株中，可導(dǎo)致雄性不育。Orf224基因是在油菜Polima胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與CMS相關(guān)的mtDNA基因，王永飛等已經(jīng)將其克隆到pBI121載體上，構(gòu)建了其植物表達(dá)載體pBRORF，欲通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法將Orf224轉(zhuǎn)入到油菜等十字花科作物的優(yōu)良品種，可望獲得新的CMS材料。

2.6 細(xì)菌基因在植物中組成型表達(dá)

農(nóng)桿菌RhizogenesA4是植物的病原物，Schmulling等將其T2DNA間的rolc基因與CaMV35S啟動(dòng)子串聯(lián)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，由于rolc的系統(tǒng)表達(dá)，使得植株在形態(tài)上發(fā)生了一系列的變化，株高下降、頂端優(yōu)勢(shì)減弱、葉片色素水平下降及雄性不育。除此之外，rolc的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和擬南芥也同樣表現(xiàn)為雄性不育，而Spena等將Rolb基因與金魚草tap1啟動(dòng)子融合后，不但使轉(zhuǎn)基因植物雄性不育，還導(dǎo)致花藥中IAA含量增加，GA含量下降，這類基因有可能通過破壞花粉細(xì)胞中的激素平衡引起花粉敗育。

2.7 通過共抑制創(chuàng)造雄性不育

這一現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于矮牽牛中的CHS基因因同源序列的共抑制而導(dǎo)致花藥和花色的改變。目前，通過共抑制導(dǎo)致雄性不育和干擾花的發(fā)育過程已進(jìn)行了不少的研究。Taylor等觀察到轉(zhuǎn)查爾酮合酶基因的矮牽牛植株產(chǎn)生的畸形花藥缺少黃酮類色素。我國學(xué)者利用此技術(shù)成功的創(chuàng)造了番茄、煙草的雄性不育。

2.8 雙重轉(zhuǎn)基因系雜交

這種方法是先把未來的母本分別導(dǎo)入兩個(gè)不同的基因，其中一個(gè)是指導(dǎo)反式激活蛋白多聚酶表達(dá)的花藥特異啟動(dòng)子，另一個(gè)是與反義RNA或多肽鏈連鎖的反式激活蛋白的目標(biāo)序列，這兩個(gè)基因單獨(dú)對(duì)雄性育性均沒有影響，但通過雜交使他們結(jié)合到一起時(shí)，后代就會(huì)100%不育。用其做母本與未轉(zhuǎn)基因的父本雜交，F(xiàn)1雜種中有75%的可育株。但是，這個(gè)途徑需要人工去雄雜交，限制了其應(yīng)用范圍，只有那些去雄容易、繁殖系數(shù)高、有好的經(jīng)濟(jì)效益的蔬菜才可能利用。

2.9 其他方法

藤曉月等發(fā)現(xiàn)雄性不育性不育系與保持系花藥中肌動(dòng)蛋白的含量存在著顯著差異。閻隆飛等將反義豌豆肌動(dòng)蛋白基因與花粉P花藥特異啟動(dòng)子連接轉(zhuǎn)化小麥和番茄，得到了花藥畸形和花粉無活力的植株。Tadege研究在有氧條件下，在丙酮酸脫羧酶和乙酰脫氫酶的作用下，植物體內(nèi)產(chǎn)生了大量的乙醛，乙醛在花粉中大量的積聚，從而造成了玉米花粉的不育。Goetz等從煙草中克隆了Nin88及其啟動(dòng)子，將其啟動(dòng)子與反義Nin88相連轉(zhuǎn)入植物，26%的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為敗育，而其它74%的植株表現(xiàn)為種子數(shù)目減少。但是，這種基于擾亂植物正常生理代謝的基因操作所得到的植物雄性不育，常伴隨著生命力下降、花期延遲、植株矮小等不良性狀。此外，利用這種方法獲得的雄性不育植株還有許多困難要克服。

3 蔬菜雄性不育基因工程

自從通過基因工程創(chuàng)造雄性不育的方法問世以來，已經(jīng)在許多作物上獲得了成功。在蔬菜育種方面，雄性不育基因工程的研究和應(yīng)用起步較晚，到目前成功報(bào)道的僅有番茄、白菜等作物。我國在這方面的研究也取得了很大的進(jìn)步。張宏、閻隆飛在番茄方面、余沛濤在大白菜方面以及沈革志、朱玉英在甘藍(lán)方面的研究都獲得了一定成就。

基因工程創(chuàng)造雄性不育技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的與現(xiàn)代育種，縮短了育種年限，并已經(jīng)在蔬菜上取得了成功。我們相信隨著研究的深入和生物技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，利用基因工程創(chuàng)造蔬菜雄性不育系的方法會(huì)更加簡(jiǎn)便、快速和有效，將雜種優(yōu)勢(shì)的利用領(lǐng)域引向更高的水平。