蔣瑞瑞 趙桂蘋 陳繼蘭 鄭麥青 劉冉冉 李 鵬 胡耀東 文杰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室,北京 100193）

與哺乳動物相比較而言,禽肉的脂肪沉積主要為皮下脂肪和腹脂,肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積僅占體脂沉積的很小一部分。腹脂通常作為下腳料被廢棄,而IMF的沉積量與肉的風(fēng)味和多汁性顯著相關(guān)[1]。由于沉積單位脂肪比沉積單位瘦肉要多耗3倍的能量,肉雞腹脂和皮脂的過多沉積,一方面造成能量浪費,另一方面也不符合人們?nèi)找嫣岣叩膶θ馄焚|(zhì)的要求。愛拔益加（AA）肉雞生長速度快,生產(chǎn)效率高,但是肉質(zhì)風(fēng)味欠佳,北京油雞生長速度慢,相對效率低,但肉質(zhì)細膩、鮮美。機體脂肪代謝和調(diào)控機制的差異是造成不同品種脂肪分布與沉積量差異的內(nèi)在機制之一,但是目前仍不十分明了。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,近年來開展了許多功能基因和候選基因的研究工作,脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、甘油三酯脂酶（ATGL）、載脂蛋白A（apoA）、載脂蛋白B （apoB）等基因是被證實了的與脂肪代謝相關(guān)的基因[2-7],為進一步的研究提供了理論基礎(chǔ)。本研究選擇了生長速度和脂肪沉積存在顯著差異的2個品種（AA肉雞和北京油雞）為研究素材,通過比較在相同日齡和不同上市日齡的體脂沉積量、血脂代謝水平、酶活以及相關(guān)基因m RNA表達量,以期在不同調(diào)控層面上探討造成品種間脂肪沉積差異的內(nèi)在調(diào)控機制,為肉雞的選育工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選用體重均一的1日齡雌性AA肉雞60只和北京油雞120只,每個品種隨機分為6個重復(fù)（AA肉雞每重復(fù)10只,北京油雞每重復(fù)20只）,飼養(yǎng)于標準雞舍。育雛前2天室溫保持35℃,從第3天開始至第28天逐漸降溫至28℃,之后維持室溫28℃,相對濕度為45%,24 h光照。自由采食和飲水。以《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（雞飼養(yǎng)標準）》（2004）建議量配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of diets（air-d ry basis）%

1.2 樣品的采集和測定

1.2.1 樣品采集和屠體指標的測量

由于生長速度的差異,AA肉雞飼養(yǎng)至56日齡進行屠宰,北京油雞分別于56日齡和114日齡（上市日齡）進行屠宰。禁食12 h后,每個重復(fù)中隨機選取6只雞稱量活體重并采集全血（3只/重復(fù),翅靜脈采血,分離血漿備用）,頸靜脈放血處死,脫毛后盡快取肝臟、胸肌和腹脂各50～100mg,速凍于液氮中,用于提取m RNA。用游標卡尺測量皮脂厚和肌間脂帶寬（3只/重復(fù)）。剝離腹脂、雙側(cè)胸肌和腿肌并稱重,計算胸肌率、腿肌率和腹脂率（相對于活體重的比例）。采用索氏抽提法測定胸肌IMF含量[8]。

1.2.2 血液生化指標的測定

用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定血漿總甘油三酯（TG,F001）、總膽固醇（TCHO, F002）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC,F003）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC,F004）、游離脂肪酸（FFA, A 042）濃度及血漿脂蛋白酯酶（LPL,A 067）活性和肝臟蘋果酸脫氫酶（MDH,A 021）活性。用雞脂聯(lián)素（adiponectin）和瘦素（leptin）ELISA試劑盒（Ad litteram Diagnostic Laboratories Inc.,USA）測定血漿中的脂聯(lián)素和瘦素濃度。

1.2.3 基因表達豐度的熒光定量分析

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和完整性。用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄,所有的cDNA用18S rRNA檢測。本研究定量的基因及其引物序列見表2。采用SYBR Green熒光染料法,在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行熒光實時定量分析。20μL反應(yīng)體系中包括:10μL 2× SYBR GreenⅠRT-PCR Master M ix（App lied Biosystems,Foster City,USA）,上下游引物各0.75μL（10 pmol/μL）,1μL cDNA模板和7.5μL無RNA酶的去離子水。循環(huán)程序為:50℃2 m in （消除非特異擴增及遺留污染）,95℃10 m in（活化Am pliTaq Gold酶）,95℃變性15s,61～65℃退火（具體基因見表2）、延伸共60 s（40個循環(huán)）,每次延伸結(jié)束后采集1次熒光信號。通過計算2-ΔΔCT值來衡量不同品種間基因相對表達量的差異[9]。ΔΔCT= （CT目的基因-CT18S rRNA）-（CT考察組-CT對照組）。本試驗以56日齡北京油雞的基因m RNA表達量為對照組,指定其表達水平為1。

表2 基因序列號及引物序列Table 2 Gene accession numbers and p rimer sequences

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件一般線性模型（GLM）中的ANOVA程序,對56日齡AA肉雞、56日齡和114日齡北京油雞的各項指標進行分析,差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果用平均值±標準誤表示,以P＜0.05為差異顯著性標準。

2 結(jié) 果

2.1 胴體品質(zhì)和脂肪沉積

由表3可知,除腹脂率和IM F含量之外,56日齡AA肉雞的各項胴體指標均顯著高于同日齡和上市日齡的北京油雞（P＜0.05）。56日齡AA肉雞腹脂率高于同日齡的北京油雞（P＜0.05）,但是低于上市日齡的北京油雞（P＜0.05）。北京油雞的半凈膛率并沒有隨日齡的增長發(fā)生顯著變化（P＞0.05）,其他指標均顯著增加（P＜0.05）。相同日齡時北京油雞IM F含量低于AA肉雞（P＜0.05）,但上市日齡時2個品種間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 愛拔益加肉雞和北京油雞胴體品質(zhì)和脂肪沉積Table 3 Carcass characteristics and fat deposition of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

2.2 血液生化指標及酶活

由表4可知,56日齡和114日齡的北京油雞血漿TG、FFA和脂聯(lián)素濃度,血漿LPL活性和肝臟MDH活性均高于56日齡AA肉雞（P＜0.05）。2個品種間HDLC濃度僅在56日齡時有顯著差異,北京油雞高于AA肉雞（P＜0.05）。品種和日齡對血漿TCHO和瘦素濃度均無顯著影響（P＞0.05）。品種對血漿LDLC濃度的影響沒有達到顯著水平（P＞0.05）,但114日齡北京油雞血漿LDLC濃度低于56日齡（P＜0.05）。隨日齡增大,北京油雞血漿脂聯(lián)素濃度和肝臟MDH活性增加（P＜0.05）,血漿HDLC濃度和LPL活性減小（P＜0.05）。

表4 愛拔益加肉雞和北京油雞血液生化指標及酶活Table 4 Blood biochem ical indices and enzyme activities of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

2.3 脂肪代謝相關(guān)基因的表達

由表5可知,56日齡AA肉雞肝臟apoA-Ⅰ基因mRNA表達量高于56日齡和114日齡北京油雞（P＜0.05）,脂聯(lián)素基因m RNA表達量高于114日齡北京油雞（P＜0.05）,56日齡北京油雞肝臟apoB基因m RNA表達量高于114日齡（P＜0.05）,但品種間差異不顯著（P＞0.05）。

表5 愛拔益加肉雞和北京油雞肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達Table 5 Related genes expression in hepatic fat of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

由表6可知,56日齡AA肉雞腹脂中的ATGL和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因m RNA表達量高于114日齡的北京油雞（P＜0.05）,脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）基因和脂聯(lián)素基因mRNA表達量低于114日齡北京油雞（P＜0.05）;56日齡AA肉雞過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）基因mRNA表達量低于56日齡北京油雞（P＜0.05）;隨著日齡的增加,北京油雞腹脂A-FABP基因m RNA表達量增加（P＜0.05）,PPARγ基因m RNA表達量降低（P＜0.05）。品種和日齡對腹脂過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）基因mRNA的表達量沒有顯著影響（P＞0.05）。

表6 愛拔益加肉雞和北京油雞腹脂脂肪代謝相關(guān)基因的表達Tab le 6 Re lated genes exp ression in abdom inal fat of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

2.4 基因表達與體重和腹脂率的相關(guān)分析

由表7的相關(guān)分析結(jié)果表明,肝臟apoA-Ⅰ、腹脂ATGL和H-FABP基因m RNA表達量與體重顯著正相關(guān)（P＜0.05）,腹脂A-FABP基因m RNA表達量與腹脂率顯著正相關(guān)（P＜0.05）。腹脂H-FABP基因m RNA表達量與腹脂ATGL基因和肝臟脂聯(lián)素基因m RNA表達量顯著正相關(guān)（P＜ 0.05）。腹脂PPARα基因m RNA表達量與腹脂ATGL、H-FABP以及肝臟apoB和脂聯(lián)素基因m RNA表達量顯著正相關(guān)（P＜0.05）。肝臟中脂聯(lián)素基因mRNA表達量與apoA-Ⅰ基因m RNA表達量顯著正相關(guān)（P＜0.05）,而腹脂中脂聯(lián)素基因m RNA表達量與A TGL基因m RNA表達量顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

表7 基因表達相關(guān)分析Tab le 7 Correlation analysis of gene exp ression

3 討 論

考慮到育肥期對脂肪沉積的影響和2個品種上市日齡的巨大差異,本研究將56日齡AA肉雞分別與56日齡（相同日齡）和114日齡（上市日齡）北京油雞各項指標進行比較。結(jié)果表明,相同日齡時AA肉雞的體增長和脂肪沉積速度均遠大于北京油雞;但是生長后期北京油雞脂肪沉積的潛力更大,腹脂率和IMF含量分別比AA肉雞高66.87%和 6.29%,其中,IMF含量的差異并沒有達到顯著水平。

家禽肝外脂肪的沉積依賴于脂蛋白代謝的2個連續(xù)步驟:1）脂蛋白的合成和轉(zhuǎn)運速率;2）脂蛋白在血管內(nèi)的降解及脂肪被脂肪組織吸收和貯存速度[10]。MDH是脂肪合成的關(guān)鍵酶之一,主要存在于肝臟,該酶活性與肉仔雞腹脂和體脂含量有關(guān)[11]。雞肝臟形成的脂肪以極低密度脂蛋白（V LDL）形式釋放出來,在LPL的作用下在外周組織被水解,產(chǎn)生的脂肪酸被外周組織吸收用于氧化或酯化并以甘油三酯的形式被貯存。56日齡和114日齡北京油雞肝臟MDH和血漿LPL活性均高于AA肉雞,提示北京油雞具有更強的脂肪合成能力和水解VLDL的能力,從而使更多的FFA進入外周組織。本試驗中2個日齡北京油雞血漿TG和FFA濃度均顯著高于AA肉雞,推測與北京油雞具有較高的肝臟MDH和血漿LPL活性有關(guān)。

apoA-Ⅰ是高密度脂蛋白（HDL）的重要組成部分,對膽固醇動態(tài)平衡起重要作用[12]。肝臟和小腸是育成雞apoA-Ⅰ合成和分泌的主要部位[13],血漿HDL濃度與肝臟apoA-Ⅰ基因mRNA水平相關(guān)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),對于北京油雞而言,肝臟apoA-Ⅰ基因mRNA表達量和HDLC濃度隨日齡的增加變化趨勢一致。AA肉雞肝臟apoA-Ⅰ基因m RNA表達量遠遠高于北京油雞,該結(jié)果與李文娟[16]報道一致。本研究相關(guān)分析結(jié)果表明,雞肝臟apoA-Ⅰ基因m RNA表達量與體重有顯著的正相關(guān)。apoB是VLDL的重要組成部分,肝臟分泌的apoB對脂肪的轉(zhuǎn)運有重要作用[17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)在apoB基因第26個外顯子的123位點堿基T同義突變?yōu)镚,同時終止密碼子500個堿基之后有9個堿基的缺失,通過單核苷酸多態(tài)性和單倍型分析,發(fā)現(xiàn)這2處核苷酸多態(tài)性可能與體增長和脂肪沉積相關(guān)。本研究結(jié)果表明,AA肉雞和北京油雞之間肝臟apoB基因mRNA表達量的差異并未達到顯著水平。

脂聯(lián)素是哺乳動物脂肪組織中大量表達的脂肪細胞因子[19],在脂肪和碳水化合物的代謝過程中起重要作用。與哺乳動物不同,M addineni等[20]研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素基因在雞體內(nèi),除了在脂肪組織中大量表達外,在肝臟、間腦、垂體前葉、腎臟、卵巢、脾臟、骨骼肌中都有表達,并且肝臟的表達量僅次于脂肪。肝臟是禽類脂肪合成的主要器官,因此本文比較了AA肉雞和北京油雞肝臟和脂肪組織脂聯(lián)素的表達情況。人類醫(yī)學(xué)研究表明:血漿脂聯(lián)素濃度與體形參數(shù)和內(nèi)臟脂肪沉積負相關(guān)[21-22],肥胖病人和小鼠的脂聯(lián)素基因m RNA水平均低于正常個體[23]。但是本研究結(jié)果并不能得出完全一致的結(jié)論,AA肉雞的血漿脂聯(lián)素濃度顯著低于北京油雞,與之相應(yīng)的是體重顯著高于北京油雞,56日齡時腹脂率高于北京油雞。同在上市日齡,AA肉雞的體重是北京油雞的將近2倍,但是腹脂率僅為北京油雞的1/2左右,此時,AA肉雞腹脂脂聯(lián)素基因m RNA表達量顯著低于114日齡北京油雞,而肝臟脂聯(lián)素基因m RNA表達量顯著高于114日齡的北京油雞。相關(guān)分析結(jié)果表明,腹脂脂聯(lián)素基因表達量與體重負相關(guān)（r=-0.35,P=0.09）,而與腹脂率正相關(guān)（r=0.39,P=0.07）,但是均未達到顯著水平。由于禽類的脂聯(lián)素在多個組織中表達,體增長和脂肪沉積可能受到各個組織表達量的綜合影響,在此我們僅探討了2個品種間肝臟和脂肪組織的表達差異。

激素敏感脂酶（HSL）一直被認為是脂肪細胞脂動員過程中唯一的脂肪水解限速酶,但是HSL基因敲除鼠的出現(xiàn)揭示了另一個脂肪分解酶的重要作用,即ATGL是啟動脂肪動員,催化甘油三酯第1步水解的關(guān)鍵酶,并證明了ATGL催化甘油三酯水解為甘油二酯,但不水解膽固醇或者視黃酯[7]。目前關(guān)于ATGL對雞脂肪沉積的影響研究鮮有報道,本研究初步比較了不同品種肉雞的腹脂ATGL基因m RNA表達量,發(fā)現(xiàn)AA肉雞腹脂ATGL基因m RNA表達量顯著高于北京油雞,提示AA肉雞腹脂脂肪動員可能比北京油雞活躍,從而導(dǎo)致品種間腹脂沉積量的差異。

H-FABP基因及A-FABP基因是影響IM F含量的候選基因[5-6]。H-、A-FABP屬于FABPs家族,是參與機體細胞內(nèi)脂肪酸的攝取,并協(xié)助其運輸?shù)囊环N蛋白質(zhì)。作為細胞內(nèi)脂肪酸及其輔酶A的貯存庫,FABPs能夠在較大范圍內(nèi)以脂肪酸濃度的方式來調(diào)控機體內(nèi)的脂類代謝過程[24-25]。本研究結(jié)果表明AA肉雞H-FABP基因m RNA表達量顯著高于北京油雞,A-FABP基因mRNA表達量顯著低于北京油雞。體重與H-FABP基因m RNA表達量顯著正相關(guān),與A-FABP基因m RNA表達量在0.10的水平上負相關(guān)。值得注意的是,當相同日齡比較時,H-FABP基因m RNA表達量與腹脂率和IM F沉積正相關(guān),但是與上市日齡比較時,卻表現(xiàn)為顯著的負效應(yīng)。A-FABP基因m RNA表達量與腹脂率顯著正相關(guān),推測A-FABP基因是造成2個品種腹脂沉積量差異的關(guān)鍵基因之一。

PPARs屬于激素核受體家族,可直接參與細胞脂類代謝,并能調(diào)控多種參與細胞脂類代謝的目的基因[3]。PPARα和PPARγ是PPARs家族的2個亞型,本研究中PPARα在品種間沒有表現(xiàn)出顯著的差異。PPARγ協(xié)同C/EBP（CCAAT）轉(zhuǎn)錄因子影響脂肪酸在脂肪組織中的貯存,能誘導(dǎo)脂肪前體細胞成熟為脂肪細胞,是脂肪細胞分化的一部分[16]。本研究發(fā)現(xiàn),56日齡的北京油雞PPARγ基因m RNA表達量顯著高于56日齡AA肉雞和114日齡北京油雞,但是上市日齡的AA肉雞和北京油雞之間沒有顯著差異。

脂肪代謝是一個多基因、多途徑的復(fù)雜過程。目前單個基因多態(tài)性和基因表達對脂類代謝的影響研究較多,但是代謝通路上各個基因之間的相互影響及調(diào)控機制并不明了。本研究通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),雞腹脂ATGL基因、PPARα基因、肝臟apoA-Ⅰ基因和脂聯(lián)素基因m RNA表達量均與腹脂H-FABP基因m RNA表達量顯著正相關(guān),同時肝臟中apoA-Ⅰ基因m RNA表達量與脂聯(lián)素基因mRNA表達量顯著正相關(guān),提示H-FABP是脂類代謝通路上的關(guān)鍵基因。肝臟脂聯(lián)素基因、apoB基因以及腹脂ATGL基因m RNA表達量與腹脂PPARα基因m RNA表達量顯著正相關(guān),也說明PPARα基因可能是代謝通路中處于調(diào)控節(jié)點的基因。這些基因表達水平之間的關(guān)系為進一步深入研究脂肪代謝的調(diào)控機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

①北京油雞血漿LPL和MDH活性高于AA肉雞,從而導(dǎo)致較高的血漿TG和FFA濃度,可能是北京油雞脂肪沉積較高的內(nèi)在因素之一。

②A-FABP基因是造成2個品種腹脂沉積量差異的關(guān)鍵基因,H-FABP是脂類代謝通路上的關(guān)鍵基因。

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（編輯 何麗霞）