任歡歡 郝 澍 車超平 張凡慶 段云兵 張源淑

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)重點動物生理生化實驗室,南京 210095）

長期以來,糖尿病一直被認(rèn)為是一種常見的嚴(yán)重危害健康的慢性終身疾病,而今糖尿病已成為現(xiàn)代人類所面臨的一個主要健康問題,其死亡率居于腫瘤、心血管疾病之后的第3位,引起了世界衛(wèi)生組織的高度重視。目前,如何對糖尿病患者進行治療和日常保健,是備受人們關(guān)注的話題。隨著功能性食品和飼料的開發(fā)研究,研究乳源生物活性肽對血糖的影響也越來越多地受到人們的關(guān)注。乳作為哺乳動物優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源、主要的鈣磷來源,同時也是乳源活性肽的重要來源,而受到優(yōu)先關(guān)注。

日本國立健康營養(yǎng)研究所最新研究發(fā)現(xiàn),同時食用米飯和牛奶可降低血糖濃度,對防治糖尿病很有幫助,但作用的有效成分不明確[1]。β-酪啡肽（β-casom orphins,β-CMs）是由酪蛋白酶解產(chǎn)生的一類肽,包括β-CM 7、β-CM 5和β-CM 4等,由Brantl等[2]首先從牛乳酪蛋白的酶解產(chǎn)物中分離出來,并證明具有阿片肽活性,能夠被納洛酮（naloxone,NaL）所逆轉(zhuǎn)。由于β-CMs分子量較小,在小腸內(nèi)可以以完整肽段的形式被機體吸收,不會引起機體的免疫排斥反應(yīng),加之其食物源的安全性,已越來越多地引起人們的重視。以往的研究發(fā)現(xiàn), β-CMs能在動物胃腸道被完整地吸收,產(chǎn)生與內(nèi)源性阿片肽類似的生理調(diào)節(jié)功能,如刺激胰島素、生長抑素的釋放,調(diào)節(jié)腸運動,提高采食量,促進腸道水分與電解質(zhì)的吸收等[3-6]。根據(jù)其刺激胰島素分泌的作用,推測其可能有降血糖效果。宗亞峰[7]研究證實體外β-CM 7能夠抑制小腸對葡萄糖的吸收,體內(nèi)灌胃具有輔助降血糖的作用,但其作用機制還不明確。相關(guān)的研究目前在國內(nèi)外均無報道。

糖尿病在臨床上以高血糖為主要特點,因而本文從葡萄糖的吸收和血糖濃度入手進行研究。血糖的來源主要是通過胃腸吸收、糖原分解和糖異生這3個途徑,而腸道吸收是最主要的途徑。小腸內(nèi)葡萄糖的吸收主要以主動方式逆濃度差轉(zhuǎn)運而實現(xiàn)。目前多數(shù)關(guān)于β-CMs的研究都是利用離體器官和組織進行的[3],而直接在體內(nèi)對β-CMs進行的研究甚少。為了探討主要的乳源活性肽β-CMs應(yīng)用于飲食和健康保健食品中可能的輔助降血糖作用,本試驗以SD大鼠為研究對象,通過體內(nèi)灌胃β-CM 5和β-CM 7及體外制作翻轉(zhuǎn)小腸囊模型[8],檢測β-CMs對大鼠血糖相關(guān)因子的影響及血糖水平的變化,目的是經(jīng)過嚴(yán)格的科學(xué)研究,確定乳中β-CMs的降糖效果和可能的降糖機制,為乳源活性肽在人類保健食品和動物飼料添加劑等方面的研究、開發(fā)和應(yīng)用提供一定的試驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物:SD大鼠,由上海實驗動物中心提供。試驗鼠用顆粒飼料購于南京協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

主要試劑:β-CM 7（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile）和β-CM 5（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly）,色譜純（純度＞97%）,美國鳳凰藥業(yè)有限公司提供;NaL、葡萄糖和糖原測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;胰島素放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

主要儀器:水浴恒溫震蕩器、高速離心機、721型分光光度計等。

1.2 體外試驗

1.2.1 體外腸囊制作

SD大鼠,雌雄不限,體重200 g左右,自由采食和飲水,斷頸處死后,參照陳其才等[8]的試驗方法制作翻轉(zhuǎn)離體小腸囊模型。

1.2.2 不同濃度β-CMs對離體小腸葡萄糖吸收的影響

β-CM 7和β-CM 5共分為4個濃度組,每組6個重復(fù)。4個濃度組的終濃度分別為0（對照組）、7.5×10-5（高劑量組）、7.5×10-6（中劑量組）、7.5×10-7mol/L（低劑量組）,分別添加于含15 mm ol/L葡萄糖的K reb's液中。將腸囊放入預(yù)熱的25℃無糖的K reb's液中,溫浴10 m in后,轉(zhuǎn)入37℃上述試驗用的K reb's液中（保持腸囊內(nèi)液面與囊外液面相平或略高）,立即通入混合氣體,并開始計時。用100μL微量進樣器每隔10m in吸取腸囊內(nèi)溶液樣品,再補充同體積的無糖K reb's液,以進行腸囊對葡萄糖吸收的動態(tài)研究,總時間為60 m in。檢測小腸囊內(nèi)溶液的葡萄糖濃度。

1.2.3 β-CM 7對小腸葡萄糖吸收的阿片機制研究

翻轉(zhuǎn)離體小腸囊的制作同1.2.1。試驗分為3組:對照組（終濃度為0 mol/Lβ-CM 7,15 mmol/L葡萄糖的K reb's液）;試驗Ⅰ組（終濃度為7.5×10-5mo l/L的β-CM 7,15 mmo l/L葡萄糖的K reb's液）;試驗Ⅱ組（終濃度為7.5×10-5mol/L的β-CM 7和1.5×10-4mol/L NaL,15mmol/L葡萄糖的K reb's液）?；靹蚝?將腸囊放入預(yù)熱的25℃無糖的K reb's液中溫浴10 min,后轉(zhuǎn)入37℃上述試驗用的K reb's液中,立即通入氧氣,并開始計時。用100μL微量進樣器每隔10 min吸取腸囊內(nèi)液體,再補充同體積的無糖K reb's液。檢測小腸囊內(nèi)溶液的葡萄糖濃度。

1.3 體內(nèi)試驗

1.3.1 試驗設(shè)計

體重約200 g的SD大鼠21只（其中11只雄性,10只雌性）,籠養(yǎng),基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),自由采食和飲水。預(yù)飼1周后將大鼠隨機分成3組,即對照組、β-CM 7組和β-CM 5組,分別灌胃生理鹽水（對照組）、7.5×10-6mol/Lβ-CM 7（β-CM 7組）和7.5×10-6mo l/Lβ-CM 5（β-CM 5組）。每天2次,每次1m L,間隔12 h,連續(xù)灌胃30 d。

1.3.2 樣品收集與保存

在試驗期內(nèi),每5 d斷尾采血并制備血清,動態(tài)檢測血清中葡萄糖濃度的變化。在第30天灌胃0.5 h后處死,并取血液、肝臟及肌肉,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 葡萄糖濃度的測定

氧化酶法測定灌胃后第5天、第10天、第15天、第20天、第25天和第30天時大鼠血清中葡萄糖濃度,具體操作按照試劑盒說明書進行。計算公式如下:

葡萄糖濃度（mmol/L）=（樣本管吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

1.3.4 大鼠肝糖原和肌糖原含量的測定

具體操作按照試劑盒說明書進行。計算公式如下:

糖原含量（mg/g組織）=（樣本管吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)管糖原含量×樣本測定前稀釋倍數(shù)×10/1.11。

1.3.5 大鼠血清胰島素含量的測定

血清中胰島素（insulin）含量的放射免疫分析（RIA）按照胰島素放射免疫分析試劑盒的說明書進行操作。FMJ-182放射免疫γ計數(shù)器檢測并獲得數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計。先對數(shù)據(jù)作單因素方差分析（One-way ANOVA）,若處理間差異顯著,再用Duncan氏多重比較,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。所有數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié) 果

2.1 體外試驗結(jié)果

2.1.1 不同濃度β-CMs對離體小腸囊葡萄糖吸收的影響

由表1可知,與對照組相比,處理30m in后, β-CM 7高劑量組的葡萄糖濃度極顯著降低（P＜0.01）,中劑量組的濃度顯著降低（P＜0.05）;處理40 m in后,高、中劑量組的葡萄糖濃度均極顯著降低（P＜0.01）;處理50 m in后,高劑量組的葡萄糖濃度極顯著降低（P＜0.01）,中劑量組的濃度顯著降低（P＜0.05）;處理60 m in后,高、中、低劑量組的葡萄糖濃度均極顯著降低（P＜0.01）。由此可以說明,β-CM 7對離體腸囊葡萄糖的吸收有抑制作用,這種抑制作用隨著β-CM 7濃度的增加而顯著增強。

由表2可知,與對照組相比,處理50 m in后,β-CM 5高、低劑量組的葡萄糖濃度均顯著降低（P＜0.05）;處理60m in后,高劑量組的葡萄糖濃度顯著降低（P＜0.05）。由此可以說明,β-CM 5對離體腸囊葡萄糖的吸收也有抑制作用。

表1 不同濃度的β-CM 7對離體腸囊葡萄糖吸收的影響Table 1 Ef fects of differentβ-CM 7 concentrations on intestinal absorption of glucose in vitro（n=6）

表2 不同濃度的β-CM 5對離體腸囊葡萄糖吸收的影響Table 2 Ef fects of differentβ-CM 5 concentrations on intestinal absorption of glucose in vitro（n=6）

2.1.2 β-CM 7對小腸囊葡萄糖吸收的阿片機制研究

如表3所示,與對照組相比,處理20m in后,試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組葡萄糖濃度均顯著下降（P＜ 0.05）;處理40m in后,試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組葡萄糖濃度均極顯著下降（P＜0.01）;處理50 m in后,試驗Ⅱ組葡萄糖濃度極顯著下降（P＜0.01）,而試驗Ⅰ組顯著下降（P＜0.05）。并且從處理10 m in到處理60 m in后,試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組葡萄糖濃度之間并無顯著差異（P＞0.05）。說明加入NaL后沒有逆轉(zhuǎn)β-CM 7對葡萄糖吸收的抑制效用,即β-CM 7抑制小腸葡萄糖吸收是通過非阿片途徑進行的。

表3 β-CM 7及NaL對小腸囊葡萄糖吸收的影響Tab le 3 Effects o fβ-CM 7 and NaL on intestinal absorp tion o f glucose in vitro（n=6）

2.2 體內(nèi)試驗結(jié)果

2.2.1 血糖濃度測定結(jié)果

血糖濃度測定結(jié)果見表4。由表4可以看出,隨著灌胃天數(shù)的增加,β-CM 7組和β-CM 5組大鼠的血糖濃度開始低于對照組。在第20天、第25天和第30天,β-CM 7組和β-CM 5組大鼠的血糖濃度均極顯著地低于對照組（P＜0.01）。由此可以說明,體內(nèi)連續(xù)灌胃β-CM 7和β-CM 5均可以降低大鼠的血糖濃度。

表4 灌胃β-CM 7和β-CM 5對大鼠血糖濃度的影響Tab le 4 Effects o f intragastricβ-CM 7 andβ-CM 5 in fusions on concentration of serum g lucose in rats （n=7,m ol/L）

2.2.2 肝糖原和肌糖原測定結(jié)果

由表5可知,大鼠肝糖原含量,β-CM 7組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）,而β-CM 5組極顯著低于對照組（P＜0.01）;β-CM 7組和β-CM 5組大鼠肌糖原含量均低于對照組,且差異極顯著（P＜0.01）。

表5 灌胃β-CM 7和β-CM 5對大鼠肝糖原和肌糖原含量的影響Table 5 Effec ts o f in tragastricβ-CM 7 andβ-CM 5 infusions on hepatic glycogen andm uscle glycogen contents in rats （n=7,mg/g）

2.2.3 大鼠血清中胰島素測定結(jié)果

結(jié)果見表6,β-CM 7組和β-CM 5組血清胰島素含量與對照組差異均不顯著（P＞0.05）,即β-CM 7和β-CM 5不是通過直接作用于胰島素而對血糖濃度的產(chǎn)生影響的。

表6 灌胃β-CM 7和β-CM5對大鼠血清胰島素濃度的影響Table 6 Effects o f intragastricβ-CM 7 andβ-CM 5 in fusions on content o f insulin in serum o f rats （n=7,μIU/m L）

3 討 論

隨著功能性食品和飼料的開發(fā)研究,乳源生物活性肽對血糖濃度影響的研究也越來越多地受到人們的關(guān)注。乳作為哺乳動物優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源、主要的鈣磷來源,同時也是乳源活性肽的重要來源,而受到優(yōu)先的關(guān)注。Blouet等[9]研究發(fā)現(xiàn)用α-乳白蛋白（乳清蛋白中主要成分）配制成營養(yǎng)混合懸液喂食雄性W istar大鼠,其進食后2 h內(nèi)的血糖水平明顯低于其他蛋白質(zhì)配方飲食組。Frid等[10]對14名Ⅱ型糖尿病患者進行的試驗觀察發(fā)現(xiàn),乳清蛋白能降低其早餐后2 h和午餐后3 h的血糖升高程度。但就現(xiàn)有研究結(jié)果,乳清蛋白降低血糖的具體機制還不甚清楚,有待繼續(xù)深入研究。

β-CMs是來源于β-酪蛋白的一類阿片肽。這類肽序列是編碼在其前體蛋白質(zhì)中,在腸道消化或者攝食過程中由蛋白水解酶消化釋放出來。其中,從β-酪蛋白釋放出的β-CM 7或β-CM 5是一類最具代表性乳源活性肽,不僅起著營養(yǎng)功能的作用,還具有重要的生理調(diào)節(jié)作用[6]。宗亞峰[7]研究發(fā)現(xiàn),β-CM 7在62.5、125.0和250.0 mg/L濃度下,對小腸囊吸收葡萄糖均有一定抑制作用,其抑制效應(yīng)呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。在本試驗的體外腸囊試驗中,β-CM 7和β-CM 5在濃度為7.5×10-7～7.5×10-5m ol/L濃度范圍內(nèi)均能抑制離體小腸囊對葡萄糖的吸收,且高、中劑量組與對照組差異顯著,說明其抑制作用的大小與濃度有關(guān),這一結(jié)果與宗亞峰[7]的結(jié)果相一致。

據(jù)報道,β-CMs能明顯提高胰島素和胰高血糖素的分泌[11],增加餐后胰島素和生長激素抑制素的含量,而這種作用能被NaL所逆轉(zhuǎn)。談寅飛等[12]的研究表明,一定濃度的β-CM 7能促進表面灌流的仔豬胃竇黏膜分泌胃泌素,NaL不能阻斷該效應(yīng),提示β-CM 7的作用和G細(xì)胞上非阿片位點有關(guān)。本試驗加入NaL后,發(fā)現(xiàn)沒有逆轉(zhuǎn)β-CM 7對小腸葡萄糖吸收的抑制作用,這與談寅飛等[12]的研究機理相似,說明β-CM 7對小腸葡萄糖吸收的抑制作用并不是通過它的阿片樣活性而實現(xiàn)的,該作用與腸細(xì)胞上的非阿片位點有關(guān),即β-CM 7抑制小腸葡萄糖的吸收是通過非阿片途徑進行的。

已有研究證實灌胃β-CM 7（濃度7.5× 10-7mm ol/L）能夠顯著降低血糖水平[7]。本試驗結(jié)果表明,體內(nèi)灌胃濃度為7.5×10-6mmol/L的β-CM 7或β-CM 5的第20天、第25天和第30天, β-CM 7組和β-CM 5組大鼠的血糖濃度均極顯著地低于對照組,說明β-CM 7和β-CM 5具有降低血糖的作用,與前人研究結(jié)果相一致。

葡萄糖是所有動物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)[13],胰島素是體內(nèi)唯一降低血糖的激素,它促進組織細(xì)胞攝取和利用葡萄糖,促進肝細(xì)胞和肌肉細(xì)胞將葡萄糖合成糖原,促進糖類轉(zhuǎn)變?yōu)橹?抑制糖的異生。本試驗研究發(fā)現(xiàn)β-CM 5組和β-CM 7組大鼠的血清胰島素水平與對照組相比差異不顯著,這表明β-CMs不是通過促進胰島素的分泌而達到降血糖效果的,即并非通過刺激胰島素分泌途徑發(fā)揮降糖作用的。有研究證實β-CMs能促進胰島素的分泌[14],而造成β-CMs生理活性功能不一的原因,可能與體內(nèi)生物環(huán)境的復(fù)雜性、試驗動物的差異（種類、性別、年齡等）、給藥劑量以及樣品的單一性等有關(guān)。目前多數(shù)關(guān)于β-CMs的研究都是利用離體器官和組織進行的[3],而直接在體內(nèi)對β-CMs進行的研究甚少,因而體內(nèi)試驗部分仍有待于進一步的研究。

在糖代謝過程中,肝臟是調(diào)節(jié)血糖濃度的主要器官。肝臟內(nèi)不僅存在很多的糖代謝途徑,而且還可以儲存糖原。當(dāng)血糖濃度過高時,一部分葡萄糖可以直接轉(zhuǎn)換為肝糖原在肝臟中儲存,從而使血糖濃度降低。本研究結(jié)果顯示,連續(xù)灌胃β-CM 7或β-CM 5后大鼠肝糖原的含量并沒有高于對照組,這說明β-CMs也不是通過將葡萄糖轉(zhuǎn)變成肝糖原這條途徑而發(fā)揮降糖作用的。但在本試驗中發(fā)現(xiàn)β-CM 7組和β-CM 5組大鼠肌糖原含量極顯著降低,提示β-CMs可能對肌糖原消耗有影響,其機制需進一步研究。

總之,β-CMs雖已明確具有降糖作用,但其降糖作用的機制以及作用劑量等仍有待于從多方面進行研究。

4 結(jié) 論

①β-CM 7和β-CM 5能通過非阿片途徑抑制小腸對葡萄糖的吸收,抑制作用的大小與濃度有關(guān)。

②β-CM 7和β-CM 5具有降血糖作用,其降低血糖的途徑不是通過轉(zhuǎn)變成肝糖原途徑,也不是通過改變胰島素分泌途徑進行的,可能與大鼠腸道葡萄糖的轉(zhuǎn)運和肌糖原的消耗有關(guān),其詳細(xì)機理有待進一步研究。

[1] Yoko W,M ichiko S,Noriko N,et al.The glycem ic index for m ixed foods betw een rice and other foods such as vinegar,soya bean,m ilk,and m ilk products [J].Health Sciences,2001,17（3）:133-142.

[2] Brantl V,Teschemacher H,Henschen A,et al.Novel opioid pep tides derived from casein（beta-casomorphins）.1.Isolation from bovine casein peptone[J]. Hoppe-seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chem ie,1979,360:1 211-1 216.

[3] Froetschel M A.Bioactive pep tides in digesta that regulategastrointestinal function and intake[J].Anim al Science,1996,74:2 500-2 508.

[4] 凌明亮,黃仁術(shù),嚴(yán)梅根,等.β-酪啡肽對早期斷奶仔豬生長性能及小腸形態(tài)、菌群、吸收功能的影響[J].糧食與飼料工業(yè),2004,11:31-33.

[5] 張源淑,宗亞峰,鄒思湘,等.仔豬胃腸道食糜和血液中酪啡肽的檢測及阿片樣活性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006,37（10）:1 063-1 066.

[6] 張源淑,鄧 艷,宋曉丹,等.酪啡肽及其酪蛋白水解肽對早期斷奶仔豬分泌性免疫球蛋白A和細(xì)胞因子水平的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2008,20（2）: 196-199.

[7] 宗亞峰.β-酪啡肽在胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和穩(wěn)定特性及其對胃腸機能的影響[D].博士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2007:104-107.

[8] 陳其才,嚴(yán)定友,吳政星.生理學(xué)實驗[M].第1版.北京:科學(xué)出版社,1995:110-113.

[9] Blouet C,M ariotti F,M ikogam i T,et al.Meal cysteine imp roves postprandial glucose control in rats fed a high-sucrose m eal[J].Journal o f Nutritional Biochem istry,2007,18:519-524.

[10] Frid A H,Nilsson M,Hoist JJ,et al.Effect of whey on blood g lucose and insulin responses to composite break fast and lunch m eals in type 2 diabetic sub jec ts [J].American Journal of Clinical Nutrition,2005, 82:69-75.

[11] Morley JE,Levine A S,Yamada T,etal.Effect of exorphins on gastrointestinal func tion,hormonal release and appetite[J].Gastroenterology,1983,84 （6）:1 517-1 523.

[12] 談寅飛,陳偉華,鄒思湘.酪啡肽對仔豬離體胃竇黏膜分泌胃泌素的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000, 23（2）:72-75.

[13] 孫海洲,盧德勛.十二指腸灌注不同水平的玉米淀粉對生長肥育綿羊小腸內(nèi)葡萄糖消化及吸收的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,1999,11（增刊）:173-185.

[14] 秦宜德,徐從貞,羅 欣,等.β-酪啡肽-7對大鼠生長、相關(guān)激素及生長素受體m RNA表達影響[J].營養(yǎng)學(xué)報,2004,26（2）:111-115.

*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:zhangyuanshu@njau.edu.cn

（編輯 李一航）