黃建華,李曉波,鄧璞紅

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

1939年Mann和Keilin[1]首次從牛紅細(xì)胞中分離出藍(lán)色含銅蛋白質(zhì),1969年Mccord和Fridovich[2]發(fā)現(xiàn)該蛋白具有催化歧化功能,故將此酶命名為超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD,EC1.15.1.1）,該酶能有效清除體內(nèi)超氧自由基,具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、增強(qiáng)人體免疫等功能.有關(guān)SOD的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,田春美等人[3]對(duì)SOD的種類分布、催化、抗氧化機(jī)理、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、生產(chǎn)方式、模擬研究及應(yīng)用等方面做了大量研究,目前在食品、化妝品、臨床上有廣泛應(yīng)用,特別近年來(lái),SOD作為日用化工產(chǎn)品和保健食品行業(yè)的重要添加劑成為人們的研究熱點(diǎn).

SOD的制備方法因原料不同而異,目前制備SOD的原料有動(dòng)物血液、微生物和動(dòng)植物組織.縱觀大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),從植物組織中提取SOD的工藝已經(jīng)成熟且廣泛應(yīng)用,如從大蒜、蘆薈、唇形科芳香植物等中提取SOD[4-7].微生物方面已從啤酒廢酵母中提取SOD[8],發(fā)酵法生產(chǎn)SOD在乳酸菌發(fā)酵[9]、枯草桿菌發(fā)酵[10]等一些特殊性質(zhì)的細(xì)菌等方面取得了很大突破,但還存在很多潛力領(lǐng)域有待開(kāi)發(fā).我國(guó)從80年代起,相繼從人、牛、豬、鴨、馬、牦牛、鹿血液中提取SOD[11-17],但很多屠宰場(chǎng)因技術(shù)問(wèn)題浪費(fèi)了很多血源,為了更好地利用動(dòng)物血液,促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,本文主要探討了動(dòng)物血液SOD的不同制備方法及在食品中的廣泛應(yīng)用、存在問(wèn)題.

1 SOD的分類

SOD是一種廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體中的金屬酶,依據(jù)金屬輔基的不同分類如下[18]：第一類,CuZn-SOD,是最常見(jiàn)的一種,呈藍(lán)綠色,有兩條肽鏈組成,每條肽鏈含有銅、鋅原子各一個(gè),主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi),如動(dòng)物血液、肝和植物體內(nèi).第二類,Mn-SOD,純品呈粉紅或紫紅色,由兩條或四條肽鏈組成,主要存在于原核細(xì)胞體、真核細(xì)胞的細(xì)胞漿和線粒體內(nèi),如人和狒狒的肝細(xì)胞的胞液.第三類：Fe-SOD,純品呈黃色或黃褐色,由兩條肽鏈組成,多數(shù)情況下一個(gè)二聚體中含一個(gè)Fe原子,主要存在于原核細(xì)胞內(nèi),如綠菌屬、脫硫弧菌屬等.Sa-Ouk Kang等人最近又從鏈霉菌Streptomyces spp.和S.coelicotor中發(fā)現(xiàn)了兩種新的SOD：Ni-SOD和Fe／Zn-SOD,它們均為四聚體,表觀分子量分別是13 KD和22 KD,它們之間沒(méi)有免疫交叉反應(yīng)[19-21].

2 催化抗氧化機(jī)理

SOD酶作用的底物是超氧陰離子自由基（O2.-）,它帶一個(gè)負(fù)電荷,又有一個(gè)未成對(duì)的電子,在不同條件下,氧負(fù)離子既可作還原劑變成O2,又可作氧化劑變成H2O2,H2O2在過(guò)氧化氫酶（Catalase,CAT）的作用下,生成H2O和O2.其作用機(jī)理如下：

3 提純工藝中關(guān)鍵操作的探討

從動(dòng)物血中提純SOD的方法很多,每種方法中操作環(huán)節(jié)各有異同,提取率差異很大,這直接關(guān)系到SOD價(jià)值利用,本文從所用試劑的安全性、采取方法對(duì)提取率的影響、程序繁瑣程度等方面對(duì)其進(jìn)行了探討.

3.1 分離紅細(xì)胞

紅細(xì)胞的分離一般采取三種方法,其一不加抗凝血?jiǎng)?直接加2倍的0.9%的氯化鈉洗滌3遍,傾干.加入與血塊等體積的去離子水,機(jī)械攪拌30min,使成溶血液,過(guò)濾,收集濾液.其二直接加萃取劑檸檬酸和檸檬酸三鈉（1∶4.5）混合,調(diào)節(jié)pH7.6,無(wú)需另加抗凝劑,取0.34倍血塊量的抗凝血?jiǎng)┡c血塊等體積的去離子水超聲破碎,萃取過(guò)程中保持pH 7.4～7.8對(duì)提取率的提高是很關(guān)鍵的.其三加抗凝血?jiǎng)?之后經(jīng)0.9%氯化鈉離心洗滌兩次,加等體積去離子水超聲破碎,經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),加抗凝血?jiǎng)┑幕钚蕴崛÷适遣患涌鼓獎(jiǎng)┹腿〉?.33倍,超聲15min破碎后SOD總活性比機(jī)械攪拌高1.2倍,時(shí)間僅15min,縮短了生產(chǎn)周期.

另外還有兩種方法：凍融處理和溶菌酶處理.前者是快速冷卻破壞細(xì)胞而使CuZn-SOD釋放出來(lái),此法易使SOD的活性損失,且設(shè)備投入大,不適合大規(guī)模生產(chǎn).后者用商品溶菌酶經(jīng)濟(jì)成本太高,若用蛋清代替溶菌酶,效果雖基本不變,但純蛋清的獲取,增加了過(guò)程的復(fù)雜性.

3.2 除雜蛋白、沉淀得粗品

SOD是酸性蛋白質(zhì),較穩(wěn)定,保守性強(qiáng),對(duì)環(huán)境pH、溫度適應(yīng)范圍廣,它在55～65℃下一定時(shí)間內(nèi)活性變化不大,熱變時(shí)間一般在10～20min.從目前研究看,各種血源處理時(shí)的熱變溫度和時(shí)間歸納如表1.試驗(yàn)表明,熱變性過(guò)程中加激活劑3%或15%CuCl2比不加激活劑的比活提高了1.8倍,因此針對(duì)不同的動(dòng)物血,可在上述范圍內(nèi)調(diào)節(jié)參數(shù),減少探索程序.

表1 不同動(dòng)物血的熱變溫度和時(shí)間

除雜蛋白通常加入0.25血塊體積的預(yù)冷（0～4℃）95%乙醇和0.15體積的預(yù)冷氯仿,攪拌15min,3 000 r/min冷凍離心30min,收集上清液,再向上清液中加入等體積的冷丙酮,靜置,離心收集沉淀.把沉淀溶于0.05mol/L的pH=7.6的磷酸氫鉀緩沖液中,之后添加1.0mL0.3mol/L氯化銅,55～65℃恒溫?zé)嶙冃?然后迅速冷卻,再用冷丙酮離心收集沉淀,最后用無(wú)水丙酮脫水,真空干燥即得粗品.由于氯仿是毒害試劑,2003年王仲禮[22]探索了不加氯仿的新工藝,這種新工藝不使用氯仿、乙醇等貴重、有害的有機(jī)溶劑,無(wú)需加入抗凝劑,而且生產(chǎn)過(guò)程所使用的丙酮液可以回收2%以上.這種方法更符合安全生產(chǎn)的要求,且周期短、收效高,適合大規(guī)模生產(chǎn).

3.3 純化得精品

這一環(huán)節(jié)操作基本相同,CuZn-SOD粗品用盡量少的去離子水溶解或者直接用磷酸鉀緩沖液溶解,裝入帶蓋塑料瓶,離心30min,除去不溶性蛋白.上清液置于透析袋中真空動(dòng)態(tài)透析,得到透析液.將透析液加到用2.5mmol/L的pH=7.6的磷酸鉀鹽緩沖液平衡好的DEAE-SephadexA50柱上吸附,用2.5～5.0mmol/L的pH=7.6的磷酸鉀鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,收集具有SOD活力的洗脫液,超濾濃縮后,冷凍干燥得到CuZn-SOD精品.此操作中注意透析在0～4℃下操作,控制好上樣流速是提高得率的關(guān)鍵.

3.4 活性檢測(cè)

根據(jù)原料的不同,常用的SOD活性測(cè)定方法如下：鄰苯三酚自氧化法[23-24]、羥胺發(fā)色法[25]、黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素法[26]、化學(xué)發(fā)光法[27-28]、電子自旋共振光譜法、氮藍(lán)四唑（NBT）改良法,在實(shí)際生產(chǎn)中力求實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),pH靈敏度要低,對(duì)O2-有高度的特異性,以下是對(duì)幾種方法的比較.

3.4.1 分光光度法 分光光度法包括黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素法和氮藍(lán)四唑（NBT）法.因?yàn)閏ytochrome C易被NADPH還原酶或其他還原劑還原,因此必須考慮對(duì)樣品的污染因素,而且,此過(guò)程需要每隔1.5min就要察看一下,不適合做大批量實(shí)驗(yàn).NBT法的原理是生成不溶于水的藍(lán)色甲臢染料（lmax：560 nm）去和O2-反應(yīng).這種染料不溶于水,在做長(zhǎng)時(shí)程分析時(shí)會(huì)生成不均一的沉淀物,從而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性.為了得到水溶性的甲臢染料,許多改良方法如添加BSA被人們所采用.但是,添加了不必要的蛋白質(zhì)會(huì)使數(shù)據(jù)分析變得十分復(fù)雜,而且NBT會(huì)被多種還原劑所還原.NBT法的最大缺點(diǎn)是即使加入過(guò)量的SOD也不能獲得100%的抑制率,原因是NBT會(huì)與黃嘌呤氧化酶直接反應(yīng).

3.4.2 鄰苯三酚自氧化法 原理：在堿性條件下,鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),并產(chǎn)生O-,在SOD存在下,自氧化反應(yīng)受到抑制.該法所用試劑和儀器比較普通,測(cè)試方便,靈敏度高,是目前應(yīng)用最廣泛的一種測(cè)試方法,但對(duì)溫度、pH、鄰苯三酚濃度、SOD待測(cè)液存放時(shí)間等諸因素比較敏感,因此測(cè)定時(shí)要嚴(yán)格控制這些因素.

3.4.3 化學(xué)發(fā)光法 用于O2-檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光探針同樣也能用于SOD的檢測(cè),這種探針?lè)譃?種,一種是光澤精,另一種是熒光素衍生物（MCLA）.這種化學(xué)發(fā)光反應(yīng)對(duì)pH有高度的依賴性.例如,光澤精只有在pH 9.0或者更高處會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的化學(xué)光.因此,在生理的pH條件下用這種方法檢測(cè)SOD是不可行的.另一方面,MCLA在生理?xiàng)l件下能夠發(fā)出較強(qiáng)的化學(xué)熒光,因此可以用于人腦的Cu,Zn-SOD活性的檢測(cè).但是,MCLA不適合用作SOD檢測(cè)的探針,因?yàn)樗粌H和O2-反應(yīng),還會(huì)和單質(zhì)氧反應(yīng).而且MCLA與溶解氧反應(yīng)后會(huì)發(fā)出化學(xué)光,轉(zhuǎn)移的金屬離子還會(huì)加速氧化反應(yīng),該法具有時(shí)間響應(yīng)快、分析精確、靈敏度高、專性強(qiáng)、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn),但需要高靈敏度的精密發(fā)光測(cè)量?jī)x器.

3.4.4 電子自旋共振（ESR）光譜法 電子自旋共振是一種檢測(cè)樣品中不成對(duì)電子特性相關(guān)研究的光譜學(xué)方法.在室溫下,溶液中O2-的ESR信號(hào)不能直接被檢測(cè)出,但能夠通過(guò)自旋捕捉法間接獲得.最常見(jiàn)的誘捕劑是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide（DMPO）.由于O2-誘捕DMPO會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特殊的光譜圖,因此ESR法是O2-檢測(cè)的方法中特異性最好的一種.然而,DMPO與O2-間的二階速度常數(shù)比O2-自發(fā)反應(yīng)常數(shù)相對(duì)要低,因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：終濃度為0.45M）.這樣,每次試驗(yàn)所要用的DMPO將花去大筆的經(jīng)費(fèi).這種方法的另一個(gè)問(wèn)題是在實(shí)驗(yàn)中需要一套較為昂貴的ESR設(shè)備.

另外還有極譜氧電極法、堿性二甲基亞砜法、堿性連二亞硫酸鈉法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法,在實(shí)際生產(chǎn)中要力求實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),pH靈敏度要低,對(duì)O2-有高度的特異性,目前從血液中提取的SOD主要采用鄰苯三酚自氧化法.

4 SOD在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

SOD是國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的最佳自由基清潔劑,它的獨(dú)特生理性質(zhì)使其在食品中的應(yīng)用成為成為眾多學(xué)者和企事業(yè)科研單位的研究亮點(diǎn).

SOD在食品中的應(yīng)用與其它抗氧化劑一樣,SOD可作為罐頭食品、果汁、啤酒等的抗氧化劑,防止過(guò)氧化酶引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象；還可作為水果、蔬菜等的良好保鮮劑.

由于絕大部分蔬菜、水果都含SOD,且水果SOD活性在儲(chǔ)藏期內(nèi)均呈下降趨勢(shì).人們就充分利用這些富含SOD的原料開(kāi)發(fā)天然保健食品如蘆薈汁、大蒜素、刺梨汁、菠蘿汁、麥綠素等.

其它含SOD的食品有：食用菌、扇貝、雞、調(diào)味品等.常見(jiàn)食用菌中猴頭菇SOD活性較強(qiáng),達(dá)3 120U/g濕菌絲.靈芝菌活性也很高,已被制成靈芝酒投放市場(chǎng).常見(jiàn)調(diào)味品中,發(fā)現(xiàn)醬油、魚(yú)露、豆腐乳中均含SOD樣活性物質(zhì),其具體性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究.

另外還可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑加入食品中制成新的保健食品,例如綠茶飲料有預(yù)防齲齒、敏感癥、痛風(fēng)、降壓、抑制氧化等作用；番木瓜SOD酒采用低溫生物技術(shù)發(fā)酵而成,是一種低度純天然的綠色健康型果露酒,能幫助消化,消除慢性胃炎,舒張血管,降低血壓等作用.目前已開(kāi)發(fā)的還有蛋黃醬、酸牛奶、可溶性咖啡、奶糖等產(chǎn)品為擴(kuò)大SOD在食品中的應(yīng)用范圍,需增強(qiáng)SOD的穩(wěn)定性,有必要對(duì)SOD進(jìn)行化學(xué)修飾,選擇無(wú)毒副作用的物質(zhì)作為修飾劑,例如肝素化合物、硫酸軟骨素、脂肪酸等,其中由玻璃酸、月桂酸修飾的SOD已投入商品化生產(chǎn).有研究表明,制成SOD脂質(zhì)體不僅能增強(qiáng)穩(wěn)定性,還能促進(jìn)人體皮膚的吸收.

動(dòng)物血液中SOD含量豐富,尤其是特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物極富藥用價(jià)值,利用動(dòng)物血液中SOD開(kāi)發(fā)的保健食品主要有：第一,保健酒的研制,其中基質(zhì)酒的選擇也是極其重要的環(huán)節(jié),能否作為基質(zhì)酒依據(jù)酒質(zhì)而定；與中藥材一起研制藥酒,目前主要研究了杜仲、白術(shù)、甘草、枸杞、雞血藤、大血藤等浸提液參與研制的復(fù)合酒.第二,抗衰老食品、口服液、片劑生產(chǎn)等.

5 亟待解決的問(wèn)題

目前由于精品SOD的提純成本較高,且SOD與過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶的協(xié)同作用對(duì)人體有更好地保健功能,因此,目前幾乎沒(méi)有單純使用SOD酶開(kāi)發(fā)功能食品和藥物的企業(yè).另外有關(guān)SOD的吸收機(jī)理、吸收率、有效劑量的基礎(chǔ)研究不夠,直接影響SOD功能性食品的研制和開(kāi)發(fā),且SOD活性在儲(chǔ)藏性的穩(wěn)定性不好,需要加強(qiáng)這方面的研究.

測(cè)定SOD活性的方法有多種,且各方法間測(cè)定結(jié)果的差異性很大,目前國(guó)內(nèi)未制定含SOD保健食品的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),這就難以規(guī)范和監(jiān)督這類功能性食品的質(zhì)量.因此,保健食品SOD標(biāo)準(zhǔn)亟待制定.

富含SOD自然資源未得到充分利用,如：刺梨中可食部分含SOD比活是一般水果的2～3倍,市場(chǎng)上未見(jiàn)其相應(yīng)的保健產(chǎn)品；大蒜SOD在20 a前就有人報(bào)道過(guò),但其產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生令人不適的酸臭味,因口感問(wèn)題使其資源利用較少,存在資源的大量浪費(fèi).動(dòng)物血液除極少部分以血粉形式供作飼料外,其它以污水形式排放,致使大量寶貴營(yíng)養(yǎng)資源流失,且造成嚴(yán)重環(huán)境污染,而一些發(fā)達(dá)的工業(yè)化國(guó)家則對(duì)血液有合理的利用.另外,我國(guó)有很多鹿養(yǎng)殖基地,目前人們從醫(yī)藥保健方面對(duì)鹿茸利用較多,對(duì)鹿血及鹿血中SOD的利用較少,除鹿血酒外很少見(jiàn)其它上市產(chǎn)品.因此,我國(guó)亟待努力推動(dòng)動(dòng)物血液的深度利用和保健食品的功能因子開(kāi)發(fā).

6 小結(jié)

動(dòng)物血液中SOD的提純工藝已基本成熟,不同的血源提取工藝上有差別,應(yīng)注意遵循環(huán)保、安全前提下,調(diào)節(jié)參數(shù)提高得率,提取過(guò)程中的副產(chǎn)物也應(yīng)當(dāng)綜合利用.針對(duì)上述問(wèn)題,我們將在下一步加強(qiáng)SOD的吸收機(jī)理、吸收率、有效劑量的基礎(chǔ)研究,盡快制定保健食品SOD統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),開(kāi)發(fā)潛在領(lǐng)域的應(yīng)用才是我們研究的主旨.

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