應(yīng)敏剛 魏植強(qiáng) 楊建偉 陳路川 鄭秋紅

我院從 2000年 12月至今在結(jié)直腸癌根治術(shù)后放化療的基礎(chǔ)上,加以熱休克蛋白負(fù)載的樹突細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK)療法,明顯降低了復(fù)發(fā)率,提高了遠(yuǎn)期生存率,現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

所選病例為 2000年 12月至 2006年 10月的住院患者共 102例,均經(jīng)病理學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)等檢查確診為結(jié)直腸癌,均行結(jié)直腸癌根治術(shù),術(shù)后病理檢查證實(shí)為 R0切除。102例患者均為 AJCC(1997)TMN分期的Ⅰ ～Ⅲ期患者,對(duì) I期患者,術(shù)后不行放化療。Ⅱ～Ⅲ期患者術(shù)后輔助化療。DC-CIK治療組 51例,男性 31例,女性 20例,年齡 28～86歲,中位年齡 59歲,Ⅰ期 6例,ⅡA期 3例,Ⅱ B期 12例,Ⅲ期 30例,術(shù)后輔助化療采用 FOLFOX方案 33例,采用 XELOX方案7例,采用 CF+5-Fu方案 3例,采用希羅達(dá)方案 2例。接受術(shù)后輔助放療 7例。對(duì)照組 51例,男性 25例,女性 26例,年齡 20～78歲,中位年齡 54歲,其中Ⅰ期 6例,ⅡA期 3例,Ⅱ B期 12例,Ⅲ期 30例,術(shù)后采用FOLFOX方案化療 35例,采用 XELOX方案 3例,采用CF+5-Fu方案 5例,采用希羅達(dá)方案 2例,接受術(shù)后輔助放療 9例。兩組患者卡氏評(píng)分均≥80分,肝、腎功能正常,外周血 WBC≥4.0×109/L,PLT≥100×109/L,H b≥80 g/L,無嚴(yán)重的內(nèi)科疾病。

1.2 主要試劑

Ficoll淋巴分離液(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 );rh IL-4(英國(guó) Pepro Tech公司);TNF-α(上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司);CD3McAb(武漢生物制品研究所);IFN-r(上海克隆公司);rh IL-2(北京瑞德合通藥業(yè)有限公司 );GM-CSF(北京聯(lián)合藥業(yè)有限公司 );RPMI1640、無血清培養(yǎng)基 AIM-V(美國(guó) Gibco公司)。

1.3 HSP70多肽復(fù)合物的制備

來源于患者自身腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系經(jīng)玻璃勻漿或超聲波粉碎后,21 000 g/min,離心 60 min,取上清,參照文獻(xiàn)[1]方法,分離純化 HSP70多肽復(fù)合物作為腫瘤抗原,用于負(fù)載 DC。

1.4 方法

參照文獻(xiàn)[2,3]方法新鮮分離的患者抗凝外周全血50ml,經(jīng)淋巴分離液梯度離心,取界面層單個(gè)核細(xì)胞,用 RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,離心洗滌細(xì)胞 3次后,收集非貼壁細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度約為 1×106個(gè)/ml,加入 γ-干擾素 1 000 U/ml,24 h后加入 rhIL-2 300U/ml,CD3McAb 70 ng/ml,IL-110U/ml,每 3天換液 1次,同時(shí)補(bǔ)加 rhIL-2 100 U/ml。在上述獲得的貼壁細(xì)胞中加入含 GM-CSF 1 000U/m l和 rh IL-41 000U/ml的 AIMV培養(yǎng)基,每 3天換液 1次。第 3天將按 5 ng/ml將HSP70多肽復(fù)合物加入 DC培養(yǎng)液內(nèi),第 5天加入TNF-α1 000 U/ml,第 7天將負(fù)載后的 DC按 1∶5的比例加入 CIK培養(yǎng)液中,共培養(yǎng) 5～7天。培養(yǎng) 10天后制成細(xì)胞懸液用輸血器回輸,隔天回輸 1次,將 DC、CIK 2種細(xì)胞體外混合后全身輸注。劑量:DC-CIK回輸 100m l/瓶,細(xì)胞數(shù)≥108個(gè)/m l,連續(xù) 8次為 1個(gè)療程。治療組患者最少行 1個(gè)療程的 DC-CIK治療,最多行 6個(gè)療程的 DC-CIK治療,平均行 4個(gè)療程的DCCIK治療,給藥時(shí)間一般在術(shù)后或化療結(jié)束后 15天開始。

1.5 化療及放療方案

所有Ⅱ～Ⅲ期患者行術(shù)后輔助化療,采用 FOLFOX、XELOX、CF+5Fu或希羅達(dá)方案化療 4～10個(gè)周期。術(shù)后對(duì)Ⅱ～Ⅲ期部分直腸癌患者輔助放療,術(shù)后4～6個(gè)周開始放療,照射劑量為每周第 1～5天,每天2 Gy,共 5周,總照射劑量為 50Gy。結(jié)腸癌患者未輔助放療。

1.6 療效評(píng)價(jià)

以復(fù)發(fā)時(shí)間和生存期作為觀察指標(biāo),觀察時(shí)間為患者手術(shù)時(shí)間到 2009年 10月 1日。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS15.0軟件包進(jìn)行生存率、無病生存率計(jì)算。應(yīng)用 Kaplan-Meier生存曲線和 Logrank test檢驗(yàn)比較兩組生存率及無病生存率。率檢驗(yàn)采用 χ2檢驗(yàn),以 P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 DC-CIK治療組與對(duì)照組臨床資料對(duì)比結(jié)果

兩組從性別、年齡、病理分期、AJCC(1997)中臨床分期、術(shù)后輔助化療方案、腫瘤部位和是否接受術(shù)后輔助放療等方面進(jìn)行比較,經(jīng)卡方檢驗(yàn),結(jié)果顯示兩組資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,具有可比性(P＞0.05)(表 1)。

表1 兩組患者的臨床資料比較

2.2 生存率

全部病例隨訪至 2009年 10月,隨訪時(shí)間為 13～62個(gè)月,無失訪,隨訪率為 100.0%。DC-CIK治療組1、2、3年生存率分別為 100.0%、92.2%、88.2%,對(duì)照組 1、2、3年生存率分別為 100.0%、86.3%和 68.6%。DC-CIK治療組和對(duì)照組中位生存期(mOS)分別為 63個(gè)月(95%CI,55-72)、52個(gè)月(95%CI,42-62)。 Kaplan-Meier生存曲線和 Logrank test檢驗(yàn)結(jié)果表明,治療組生存期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05),見圖 1。

圖1 兩組總生存率比較

2.3 無病生存率分析

全部病例隨訪至 2009年 10月,隨訪時(shí)間為 1～62個(gè)月,無失訪,隨訪率為 100.0%。DC-CIK治療組 1、2、3年無病生存率(DFS)分別為 80.4%、54.9%、43.1%,對(duì)照組 1、2、3年無病生存率(DFS)分別為54.9%、33.3%和 27.5%。治療組和對(duì)照組中位無病生存時(shí)間(mDFS)分別為 34個(gè)月(95%CI,28-40)、25個(gè)月 (95%CI,19-31)。Kap lan-Meier生存曲線和Logrank test檢驗(yàn)結(jié)果表明治療組無病生存率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),見圖 2。

圖2 兩組無病生存率比較

3 討論

DC-CIK細(xì)胞具有增殖快、殺傷活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),在結(jié)直腸癌的治療中具有廣闊應(yīng)用前景。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 CIK細(xì)胞(cytokine-induced killer cells)是1種新型免疫活性細(xì)胞,兼有 T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和自然殺傷(natural killer cell,NK)細(xì)胞的非主要組織相關(guān)性復(fù)合物限制性殺瘤的特點(diǎn),殺傷活性可達(dá) 84.7%。樹突細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,可有效激發(fā) T細(xì)胞應(yīng)答,有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。但腫瘤抗原肽的分子量均較小,難以直接被 DC所攝取;即使被DC攝取,亦不能有效的促進(jìn) DC成熟并表達(dá)各種黏附分子,缺乏激活 T細(xì)胞的第二信號(hào),難以形成有效的免疫應(yīng)答[4]。HSP的中文全稱是 “熱休克蛋白”,可與小分子腫瘤抗原肽結(jié)合,增強(qiáng)其免疫原性。腫瘤細(xì)胞中 HSPs結(jié)合有大量腫瘤細(xì)胞特異性抗原,因其攜帶幾乎所有腫瘤抗原,故從腫瘤細(xì)胞中獲取 HSP70多肽復(fù)合物,既可得到該腫瘤細(xì)胞高效、強(qiáng)免疫原性的腫瘤抗原,同時(shí),由于 HSPs為高度保守蛋白質(zhì),同種內(nèi)不具多態(tài)性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)同一腫瘤內(nèi)的所有瘤細(xì)胞特異殺傷,克服了腫瘤免疫治療中難解決的抗原多變性及細(xì)胞異質(zhì)性的問題。DC與經(jīng)純化的腫瘤 HSP70多肽復(fù)合物結(jié)合負(fù)載后,可活化機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫反應(yīng),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)壽(long-lasting)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。張嵩等[5]以白血病細(xì)胞系 NB4建立裸鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的 15 d,DC-CIK細(xì)胞較 CIK細(xì)胞增殖率明顯提高,并可明顯抑制腫瘤的成瘤率,予BAUl/c裸鼠經(jīng)尾靜脈注射 LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞建立轉(zhuǎn)移性肺癌模型.并以 DC-CIK細(xì)胞進(jìn)行免疫治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn) DC-CIK細(xì)胞較 CIK細(xì)胞有更強(qiáng)的殺瘤活性.可有效抑制血源性腫瘤轉(zhuǎn)移,延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間。張京雨等[6]報(bào)道化療聯(lián)合 CIK細(xì)胞回輸?shù)慕Y(jié)直腸癌患者 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK均顯著高于化療前組,且 CD8+顯著低于對(duì)照組,說明化療后及時(shí)應(yīng)用CIK細(xì)胞回輸可顯著改善結(jié)直腸癌的免疫功能,有助于提高機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)。

本研究采用了 HPS70負(fù)載的 DC-CIK,明顯提高了腫瘤特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),誘導(dǎo)高效的抗腫瘤免疫效應(yīng),結(jié)果顯示DC-CIK治療組 3年生存率及 3年無病生存率明顯高于對(duì)照組,因此結(jié)直腸根治術(shù)后放化療聯(lián)合應(yīng)用HPS70負(fù)載的 DC-CIK是安全有效的,結(jié)直腸癌根治術(shù)后放化療聯(lián)合 DC-CIK細(xì)胞療法能明顯減低復(fù)發(fā)率,并很有可能對(duì)提高結(jié)直腸癌患者的遠(yuǎn)期生存率有幫助。

[1] 應(yīng)敏剛,劉 勝,龔福生,等.快速蛋白液相色譜系統(tǒng)分離與純化小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熱休克蛋白 70〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2007,14(18):1386.

[2] 鄭秋紅,鄭天榮,謝云青,等.樹突狀細(xì)胞對(duì)自體 CIK細(xì)胞體外殺傷肺腺癌細(xì)胞影響的研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2005,12(16):1237.

[3] 鄭秋紅,鄭天榮,盧 林,等.人外周血樹突細(xì)胞的分離與提純〔J〕.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,34(2):115.

[4] Frank O,Nestle,Jacques B.Dendritic cells:on themove from bench to bedside〔J〕.Nature Medicine,2001,7:761.

[5] 張 嵩,張尚權(quán),白春學(xué).樹突狀細(xì)胞與同源細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(5):315.

[6] 張京雨,張曉明.CIK細(xì)胞過繼性免疫治療對(duì)結(jié)直腸癌化療患者免疫指標(biāo)的影響 〔J〕.腫瘤學(xué)基礎(chǔ)與臨床,2009,22(1):51.