蘇嵐 萬莉紅,2 謝一舟 汪宇輝 劉延友 王正榮△

(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院時間生物學衛(wèi)生部重點實驗室,四川 成都 610041;2.四川大學華西基礎與法醫(yī)學院藥理教研室,四川 成都 610041)

目前我國藥物濫用所致成癮的人數日益增多,其機制主要與一些神經遞質的紊亂和失調有關[1],且這些藥物通過不同通路激活大腦中的獎賞中樞即中腦邊緣多巴胺系統[2]。海馬主要通過乙酰膽堿、5-羥色胺等神經遞質參與腦的學習記憶過程[3],大量研究證實藥物依賴的實質是一個惡性學習記憶過程,通過影響神經遞質及受體導致學習記憶功能不同程度的下降[3]。同時研究發(fā)現酒精依賴可以導致大腦中腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)表達的改變,這一作用過程是由C激酶受體1蛋白(Rack1)所介導的[4]。然而Rack1在慢性嗎啡所導致的藥物成癮過程中是否也有作用尚無報道。因此,本研究亦在探討Rack1在慢性嗎啡成癮小鼠海馬中的作用及初步分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

4～6周齡健康雄性ICR小鼠30只,由成都達碩動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)于22℃、55%的濕度、光暗循環(huán) 12：12的條件下,均可自由攝取食物和水。按照隨機分組原則,分為空質粒+生理鹽水對照組(A),空質粒+嗎啡成癮組(B),shRack1+嗎啡成癮組(C),每組10只。

1.2 實驗試劑

shRack1和對照質粒由本實驗室汪宇輝博士提供,鹽酸嗎啡(四川醫(yī)藥總公司),Trizol(Invitrogen),RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司),引物(上海英駿生物技術有限公司)序列見表1,DL2000 DNA Marker(TaKaRa),鼠抗人 Rack1單抗、鼠抗羊BDNF單抗(Santa),兔抗鼠 IgG/HRP(中杉公司),免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 條件性位置偏愛實驗(CPP)測定嗎啡獎賞效應

預試期：小鼠自由活動后第3d測試小鼠的天然傾向。將測試箱中的隔板打開,把小鼠放入白箱中,允許探索黑、白箱5min,記錄每只小鼠15min內在白箱中的停留時間。

表1 引物序列

給藥及訓練期：第4-11d給藥。用隔板封閉黑白箱通道。受試動物10：00分別皮下注射生理鹽水(A組,10mg?kg-1)和嗎啡(B、C組,10mg?kg-1),放入白箱內停留30min。次日全部注射生理鹽水,放入黑箱內停留30min。并且每日16：00腦室注射空質粒(A、B組)和 shRack1質粒(C組)20μ l,共 8d。

測試期：第12d不給藥,打開中間隔板,將小鼠放入黑、白兩箱中間,讓其自由活動,記錄15min內小鼠在白箱中停留時間。如果小鼠在白箱中停留的時間延長,表示它對該側偏愛。

1.3.2 RT-PCR測定海馬Rack1以及BDNF mRNA的表達

將小鼠處死,快速開顱取腦,碎冰上分離出海馬,按照試劑說明提取組織總RNA,用分光光度計鑒定總RNA樣品。取總RNA 2μ g,根據RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA。Rack1 PCR擴增條件為：變性 94℃2min;94℃30s,52℃30s,72℃2min,共30個循環(huán),72℃延伸8min。BDNF PCR擴增條件為：變性94℃2min;94℃30s,51.4℃30s,72℃2min,共 30個循環(huán),72℃延伸8min。β-actin PCR擴增條件為：變性94℃2min;94℃30s,52℃30s,72℃2min,共30個循環(huán),72℃延伸8min。PCR產物經15g?L-1的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統成像,Quantity One專業(yè)分析軟件讀取條帶灰度值(IOD值),以目的條帶和β-actin條帶的比值作為目的基因的相對表達量。

1.3.3 免疫組化測定海馬Rack1以及BDNF蛋白的表達

用4%的甲醛溶液將海馬組織標本固定48h,等級脫水后石蠟包埋,切片,厚度約 3～5μ m。石蠟切片常規(guī)脫蠟,3%H202室溫孵育15min,以阻斷內源性過氧化物酶,熱抗原修復10min,室溫冷卻30min。10%正常山羊血清封閉 15min,滴加1：100稀釋的一抗 Rack1和BDNF,4℃過夜,二抗37℃孵育15min,滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,37℃孵育15min,DAB顯色劑顯色5min,蘇木素復染,封片。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠CPP的影響

給藥前各組小鼠在白箱停留時間差異均無統計學意義(P＞0.05)。給藥后與A組相比,B、C組小鼠在白箱停留時間明顯增加(P＜0.05),說明嗎啡成功誘導小鼠產生位置偏愛,而C組與B組相比,C組小鼠在白箱的停留時間較少(P＜0.05),說明shRack1抑制了嗎啡誘導的CPP效應(見表2)。

表2 各組小鼠在白箱內停留的時間(,n=10)

表2 各組小鼠在白箱內停留的時間(,n=10)

△注：與 A 組相比,＊P＜0.05;與B組相比,△P＜0.05(下同)A：空質粒+生理鹽水對照組,B：空質粒+嗎啡成癮組,C：shRack1+嗎啡成癮組(下同)

組別 給藥前(s) 給藥后(s)A 255.500±172.062 297.330±111.182 B 294.600±58.282 794.800±64.363＊C 283.000±60.469 462.800±72.530△

2.2 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬 Rack1以及BDNF mRNA表達的影響

與A組相比,B組的Rack1以及BDNF mRNA的表達明顯增高,說明嗎啡對其有促進作用,C組與B組相比,Rack1 mRNA的表達下調(P＜0.05),說明 shRack1干擾成功,BDNF mRNA表達下調,說明shRack1對其有抑制作用(見圖1、表 3)。

圖1 小鼠海馬Rack1和BDNF mRNA的電泳結果

表3 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬Rack1和BDNFmRNA表達的影響±s,n=10)

表3 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬Rack1和BDNFmRNA表達的影響±s,n=10)

組別 Rack1(OD) BDNF(OD)A 1.75±0.1 1.61±0.15 B 2.62±0.1＊ 2.25±0.2＊C 2.2±0.2△ 1.65±0.1△

2.3 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬Rack1以及BDNF蛋白表達的影響

B組與A組相比,海馬區(qū)有陽性表達,說明慢性嗎啡成癮可導致Rack1以及BDNF蛋白表達增加。C組與B組相比,海馬區(qū)的陽性表達明顯減少,說明shRack1干擾成功,且對BDNF蛋白表達有抑制作用(見圖2)。

圖2 小鼠海馬Rack 1和BDNF蛋白的表達情況(免疫組化SP×400)

3 討論

藥物成癮可看作是一個惡性學習記憶過程,產生成癮記憶[5]。海馬為腦內學習記憶的主要器官[6],在藥物成癮過程中同樣發(fā)揮著重要作用。有研究表明,藥物成癮的相關大腦回路與已知的記憶存儲相關回路有很多相似之處,通過電刺激成癮模型大鼠海馬的谷氨酸豐富區(qū),會引起動物對成癮藥物的強烈渴望,而刺激其它腦區(qū)則無效,進一步說明了海馬記憶中心及其神經回路在成癮過程中的關鍵作用[7]。

BDNF屬于神經營養(yǎng)因子家族,又稱神經營養(yǎng)素。主要分布在海馬、杏仁核和皮質,可通過靶源性、自分泌、旁分泌方式與神經細胞上高親和性的酪氨酸激酶受體B(TrkB)以及低親和性的p75神經肽受體結合,產生細胞內的級聯反應[8-11]。這些細胞內的信號機制可以通過多巴胺和谷氨酸神經遞質的刺激而激活[12-13]。當成癮藥物刺激后,多巴胺增多,谷氨酸的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體顯著上調[2],這就意味著成癮藥物通過對這些遞質的作用可能會激活BDNF的通路,從而激活下游級聯反應。Rack1具有7個W40結構域,能夠結合SH2結構域和Fyn[14-15]。有研究表明,當cAMP/PKA信號通路的激活導致Rack1從NR2B和Fyn上解離并釋放出來時,在體外培養(yǎng)的海馬神經元細胞中,大量釋放出的Rack1入核,這些進入核內的Rack1反過來調節(jié)BDNF的表達[16]。

通過條件性位置偏愛實驗,我們發(fā)現給藥組小鼠在白箱停留時間明顯長于生理鹽水組,這說明小鼠通過訓練對白箱給藥行為產生了記憶。與對照組相比,嗎啡組小鼠海馬區(qū)的BDNF的mRNA和蛋白質表達水平都有明顯的升高,但是在Rack 1干擾質粒的作用下,卻都有明顯的下降,說明在嗎啡作用后,激活了BDNF的通路,從而使cAMP/PKA信號通路激活,Rack 1從NR2B和Fyn上解離并釋放出來,進而反過來調節(jié)了BDNF的表達。藥物依賴是一個復雜的神經過程,涉及了各種神經遞質以及不同的腦區(qū),而Rack1在其他腦區(qū)的作用還值得我們進一步的研究。

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