張文俊，張宇鋒

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

β-NGF融合蛋白的表達(dá)及其三步層析純化工藝

張文俊，張宇鋒

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá) HIR-β-NGF融合蛋白的工程細(xì)胞株 CHO，收集上清后，通過(guò)濃縮、過(guò)濾預(yù)處理，并采用親和層析、陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析三步法工藝對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，最后用 Fc ELISA、CHOP ELISA、Western-blot等方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HIR-β-NGF融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為 190 kDa；蛋白收率達(dá)47.0%；經(jīng)純化后雜質(zhì)DNA含量可降低到2.3 ng/mg以下，CHOP蛋白降到2.3 ng/mg以下，Protein A蛋白降低到49.8 ng/mg；產(chǎn)物僅有3.51%發(fā)生聚集；免疫印跡證明具有生物活性.該純化工藝產(chǎn)品收率高，純度高，質(zhì)量檢驗(yàn)方法穩(wěn)定可靠，為大規(guī)模生產(chǎn)該蛋白提供參考.

神經(jīng)生長(zhǎng)因子；人胰島素受體；融合蛋白；發(fā)酵純化工藝；質(zhì)量控制

β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-nerve growth factor，β-NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)的，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促神經(jīng)突起生長(zhǎng)等生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子.包含α、β、γ 3個(gè)亞基，其中β亞基是活性區(qū)，由2個(gè)118個(gè)氨基酸組成的單鏈通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合而成[1-2].它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生具有重要的調(diào)控作用[3-4].然而作為一種藥理作用明確的生物大分子，在開(kāi)發(fā)成藥時(shí)一方面面臨β-NGF自身無(wú)法穿透血腦屏障問(wèn)題[5]，另一方面也受到β-NGF在體內(nèi)含量較低、來(lái)源有限的限制[6].因此如何對(duì)其進(jìn)行改造并大量制備，已成為當(dāng)前β-NGF研究領(lǐng)域中的一個(gè)極具實(shí)用價(jià)值的熱點(diǎn)問(wèn)題.

近年來(lái)，研究人員利用腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜中大量分布的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體等，將外源藥物與這些受體的特異性抗體相連，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將藥物轉(zhuǎn)到腦組織中[7-8].因此，筆者首先將編碼人的抗胰島素受體的抗體(human insulin receptor monoclonal antibody，HIR MAb)基因與編碼人β-NGF的基因片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)染并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞株.然后經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì) HIR- β-NGF進(jìn)行表達(dá)，探索三步層析大規(guī)模純化 HIR- β-NGF的生產(chǎn)工藝，并對(duì)其質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)行研究，為HIR- β-NGF大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器及原料

β-NGF基因片段由中國(guó)藥品生物制品檢定所惠贈(zèng).SUNRISE酶標(biāo)儀購(gòu)自 TECAN；微型蛋白電泳裝置和微型轉(zhuǎn)膜裝置購(gòu)自Bio-Rad公司；Centriprep-30、70 mL離心超濾裝置購(gòu)自 Millipore公司；Centrifuge 5810R型離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自 Corning公司；SP-Sepharose FF、Q-Sepharose FF購(gòu)自 GE Healthcare；Protein A 填料購(gòu)自 Amersham Biosciences；8000-14000 Da透析袋購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Sartocon 50,kD購(gòu)自Sartorius.

鼠抗人IgG1Fc 購(gòu)自Zymed公司；人IgG κ鏈標(biāo)準(zhǔn)品、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人 κ鏈購(gòu)自 Sigma公司；羊抗人 IgG(H+L)、生物素化馬抗羊 IgG(H+L)、兔抗β-NGF多抗和生物素化羊抗兔 IgG(H+L)購(gòu)自 Vector公司；生物素標(biāo)記的抗 Protein A、羊抗CHOP IgG、HRP標(biāo)記的抗 CHOP購(gòu)自 Cygnus技術(shù)公司；ABC 試劑盒和 DAB試劑盒購(gòu)自 Vector Lab；PVDF Immobion-P膜購(gòu)自Millipore公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司；預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購(gòu)自 Bio-Rad公司；Tris、MES、SDS和 Glysine購(gòu)自BBI公司.

1.2 細(xì)胞株的構(gòu)建及培養(yǎng)

將β-NGF片段亞克隆至含有 HIR MAb基因的載體上，得到含有融合基因的 pHIR MAb-β-NGF質(zhì)粒.用 Pvu I限制性內(nèi)切酶酶切得到線性化的質(zhì)粒，160,V的電壓條件下電轉(zhuǎn)化進(jìn)入 CHO細(xì)胞.用含0.54,mg/mLG418的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行初篩.2周后選取陽(yáng)性克隆，以不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶的CD培養(yǎng)基(含有 100,nm,MTX)篩選抗 MTX的細(xì)胞克隆.MTX 的量從 20,nmol/L 增加至 80,nmol/L，通過(guò)漸增 MTX的濃度使細(xì)胞中的 DHFR基因以及與DHFR基因相連的目的基因得到大量擴(kuò)增，進(jìn)而提高目的基因的表達(dá)量.以表達(dá)量最高的細(xì)胞株為種子細(xì)胞株，并將該細(xì)胞株擴(kuò)增建立原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).

HIR- β-NGF融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意如圖 1所示，人抗HIR的免疫球蛋白IgG恒定區(qū)Fc段由二硫鍵相連，2個(gè)β-NGF各通過(guò)一個(gè)氨基酸的肽接頭與恒定區(qū)連接.

圖1 HIR MAb-β-NGF融合蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of HIR MAb-β-NGF

1.3 三步法純化融合蛋白

1.3.1 Protein A親和層析

用 5個(gè)柱體積的 buffer A(25,mmol/L Tris，25,mmol/L NaCl，5,mmol/L EDTA，pH＝7.1)以 3.5,mL/min的流速平衡 Protein A柱子.取 3.4,L的發(fā)酵上清，用 Sartocon 50,kD 切向流過(guò)濾系統(tǒng)濃縮至400,mL，并用 0.45,μm 的濾膜過(guò)濾.以 3.5,mL/min的速度將樣品加到柱子上，上樣完成以相同流速換用Buffer A沖洗層析柱40,min，之后用1,mol/L NaCl洗脫層析柱，換用 30,mL Buffer A 沖洗柱子，并用70,mL Buffer B (25,mmol/L Tris，1,mol/L NaCl，5,mmol/L EDTA)洗脫重組蛋白，收集流出組分，待曲線到達(dá)基線后停止收集，共得到25,mL蛋白流出液.

1.3.2 SP-Sepharose FF陽(yáng)離子交換層析

用 50 mL 的 Buffer C(0.02,mol/L MES，0.25 mol/L NaCl，pH＝5.5)以3.5,mL/min的流速?zèng)_洗SPSepharose FF陽(yáng)離子交換柱，并用 50,mL Buffer D(0.02 mol/L MES，0.05 mol/L NaCl，pH＝5.5)平衡層析柱.將 1.3.1節(jié)得到的 25,mL 流出液，用Centriprep-30在 1,500g的轉(zhuǎn)速下離心 120,min，得到5,mL液體.加入45,mL Buffer D和10,mL去離子水后，以2.5,mL/min的速度將樣品加到層析柱上.之后以3.5 mL/min的流速，先后用50,mL Buffer D、30,mL Buffer C、25,mL Buffer E(0.02,mol/L MES，0.35,mol/L NaCl，pH＝5.5)、50 mL Buffer F(0.02,mol/L MES，0.5 mol/L NaCl，pH＝ 5.5)和 50,mL Buffer G(0.02,mol/L MES，1,mol/L NaCl，pH＝5.5)洗脫層析柱，每5,mL收集流出液，用Fc ELISA方法測(cè)定流出液中融合蛋白的濃度.

1.3.3 Q-Sepharose FF陰離子交換層析

將1.3.2節(jié)中用Buffer C洗脫得到的27,mL洗脫液，用 Centriprep-30濃縮至 3.8,mL后加入去離子水稀釋到16.8,mL，并以2.5,mL/min的速度加到已經(jīng)平衡好的Q-Sepharose FF層析柱上進(jìn)行進(jìn)一步純化.先后用 25,mL的 Buffer H(0.025,mol/L Na2HPO4，0.05 mol/L NaCl，pH＝7.0)、Buffer I(0.025,mol/L Na2HPO4，0.25,mol/L NaCl，pH＝7.0)、Buffer J(0.025,mol/L Na2HPO4，0.5,mol/L NaCl，pH＝7.0)和 Buffer K(0.025 mol/L Na2HPO4，1,mol/L NaCl，pH＝7.0)洗脫層析柱，每5,mL收集流出液.將用Buffer J洗脫得到的35 mL流出液，用Centriprep-30進(jìn)行濃縮后，對(duì)其中的蛋白進(jìn)行鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià).

1.4 Fc ELISA法測(cè)定抗體濃度

采用雙抗體夾心法測(cè)定融合蛋白的濃度.用100,μL 10,μg/mL 鼠抗人IgG1Fc將酶標(biāo)板包被過(guò)夜.次日用 PBST溶液洗板后，封閉液封閉30,min.加入100,μL 400,ng/mL、100,ng/mL、30,ng/mL、10,ng/mL、3,ng/mL、1,ng/mL和 0,ng/mL的人 IgG κ鏈標(biāo)準(zhǔn)品，37,℃孵育 60,min.用 PBST洗板并加入 100,μL 0.125,μg/mL 堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人κ鏈二抗，室溫孵育60,min.PBST洗板后，每孔加入100,μL PNPP試劑，暗處放置3,min，用1.2,mol/L NaOH終止反應(yīng)，測(cè)定A405，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品的蛋白濃度.

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

將 1.3.3節(jié)得到的蛋白進(jìn)行還原態(tài)(reducing-PAGE)和非還原態(tài)(nonreducing-PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳，方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9] .

1.6 蛋白質(zhì)印跡

采用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后針對(duì) hIgG和β-NGF進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting).在hIgG的Western blotting中，一抗選用羊抗hIgG(H+L)，二抗選用生物素化馬抗羊IgG(H+L).在β-NGF的Western blotting中，一抗選用兔抗β-NGF多抗，二抗選用生物素化羊抗兔 IgG(H+L).二者均采用DAB顯色，待轉(zhuǎn)印膜顯色合適停止顯色.轉(zhuǎn)移膜置空氣中干燥后，掃描留存轉(zhuǎn)印圖.

1.7 Protein A蛋白殘留的測(cè)定

將融合蛋白的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與蛋白變性緩沖溶液按照體積比為 1∶4混合并置于沸水中煮沸5,min，待冷卻到室溫后，6,000g離心 5,min，取上清待檢.另取50,μL制備好的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入到已經(jīng)用Protein A多克隆抗體包被的板條中，室溫孵育60,min.用洗液洗板后加入 100,μL生物素標(biāo)記的抗Protein A的二抗于孔板內(nèi)，室溫放置60,min.洗滌5次后加入 100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的 Streptavidin并洗滌板框.加入 100,μL PNPP溶液室溫孵育 45,min后測(cè)定A405，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中的Protein A含量.

1.8 宿主細(xì)胞CHO蛋白殘留量測(cè)定

CHO 宿主細(xì)胞蛋白(CHO protein，CHOP)殘留量采用雙抗體夾心 ELISA法進(jìn)行測(cè)定.一抗選用羊抗CHOP IgG，二抗選用 HRP標(biāo)記的抗CHOP，標(biāo)準(zhǔn)品 CHOP 稀釋成 40,ng/mL、10,ng/mL、3,ng/mL、1,ng/mL、0.3,ng/mL、0.1,ng/mL 和 0,ng/mL，顯色底物選用OPD，操作步驟同1.4節(jié).

1.9 DNA含量測(cè)定

采用Molecular Probes公司的Quant-iT DNA檢測(cè)試劑盒，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.

1.10 Native-PAGE

將純化得到的樣品進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE)以考察其產(chǎn)物的凝聚程度，電泳時(shí)以HIR MAb和hIgG為對(duì)照，方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9].

2 結(jié)果與討論

2.1 融合蛋白的純化

利用 CHO細(xì)胞表達(dá)外源融合蛋白，產(chǎn)物中殘留的CHOP不僅具有毒性，而且有可能引起過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)殘留的DNA也是潛在的致癌性雜質(zhì)，因此需要對(duì)表達(dá)出的融合蛋白進(jìn)行純化[10-11].實(shí)驗(yàn)首先采用Protein A親和層析的方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行捕獲，其次采用陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析的方法對(duì)發(fā)酵的上清液進(jìn)行純化，以期降低融合蛋白中的CHOP、宿主DNA以及純化工藝中引入的Protein A等雜質(zhì)，得到純度較高的HIR MAb-β-NGF融合蛋白[12].具體步驟按照 1.3節(jié)進(jìn)行，其中每一步的色譜圖見(jiàn)圖 2.

在圖2(a)中，當(dāng)樣品加入到層析柱后，換用洗脫緩沖液B，在76,min時(shí)產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收峰，融合蛋白被洗脫出來(lái)，收集該組分得到融合蛋白的粗品.將上述得到的融合蛋白采用SP-Sepharose FF進(jìn)一步純化，隨著NaCl濃度從0.05,mol/L逐漸升高到0.5,mol/L，洗脫液中的離子強(qiáng)度逐漸增加，最終在NaCl為 0.5,mol/L時(shí)融合蛋白被洗脫液從層析柱上洗脫出來(lái)，對(duì)應(yīng)于圖 2(b)中保留時(shí)間為40,min的峰.將該峰對(duì)應(yīng)的洗脫液進(jìn)一步進(jìn)行 Q-Sepharose FF的純化(見(jiàn)圖2(c))，洗脫液中 NaCl濃度為 0.05,mol/L時(shí)，大部分融合蛋白被洗脫出來(lái)，對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間為 35,min.收集該組份進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè).采用1.4節(jié)的方法，對(duì)每一步中融合蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，列于表1中.從表1中可以看出，經(jīng)過(guò)三步純化，最終蛋白的得率為47.0%.

圖2 三步法分離純化融合蛋白色譜圖Fig.2 Three-step purification chromatogram of fusion protein

表1 三步法純化工藝中融合蛋白的收率Tab.1 Fusion protein recovery during three-step purification process

2.2 融合蛋白的鑒定

將純化得到的重組蛋白樣品進(jìn)行非還原態(tài)和還原態(tài)聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖 3.從圖 3(a)中可以看出，融合蛋白比 HIR MAb抗體的相對(duì)分子質(zhì)量要略大，約為 190 kDa；從圖 3(b)中可以看出，HIR MAb-β-NGF融合蛋白的重鏈條帶b的相對(duì)分子質(zhì)量大于 HIR MAb的重鏈條帶 a.這些結(jié)果均表明 β-NGF被融合到了HIR MAb的重鏈上.

圖3 重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.3 SDS-PAGE of fusion protein

按照 1.6節(jié)的方法，對(duì)純化后的融合蛋白樣品進(jìn)行 hIgG和β-NGF的免疫印跡，結(jié)果如圖 4所示.在圖4(a)中，在2和3下方有條帶，而在1下方則沒(méi)有條帶產(chǎn)生；在圖4(b)中，含有β-NGF的1下方和2下方有條帶產(chǎn)生，結(jié)果表明不僅β-NGF被連接到融合蛋白上，而且融合蛋白 HIR-β-NGF可分別與抗 HIR MAb的抗體和β-NGF的抗體特異性結(jié)合，保持了各自蛋白的生物活性.

圖4 重組蛋白的免疫印跡Fig.4 Western blot of fusion protein

2.3 融合蛋白的質(zhì)量研究

生物制品生產(chǎn)過(guò)程中存在許多影響產(chǎn)品質(zhì)量的殘留物，諸如重組表達(dá)系統(tǒng)中宿主細(xì)胞蛋白以及生物制品加工過(guò)程中殘留的污染物[13].在本研究中，由于采用 CHO細(xì)胞重組表達(dá)外源蛋白，其殘留的宿主細(xì)胞蛋白 CHOP、宿主 DNA以及在融合蛋白純化過(guò)程中引入的Protein A雜質(zhì)是影響融合蛋白質(zhì)量的主要因素.本實(shí)驗(yàn)中采用1.7節(jié)、1.8節(jié)和1.9節(jié)的方法對(duì)HIR MAb-β-NGF融合蛋白純化過(guò)程中的 DNA、CHOP以及protein A進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 純化過(guò)程中雜質(zhì)含量的測(cè)定Tab.2 Determination of impurity contents during purification process

在對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析的過(guò)程中，融合蛋白利用其Fc段和Protein A的特異性結(jié)合，可以被填料所吸附，而CHOP和宿主DNA等在內(nèi)的雜質(zhì)大部分隨著洗脫液流出.從表 2中可以看出，幾乎全部的宿主DNA和CHOP在這一步得到了去除.但與此同時(shí)，由于使用了protein A作為親和層析介質(zhì)，有微量的protein A從填料上脫落混雜在融合蛋白中.已有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，Protein A常與抗體結(jié)合形成A-IgG復(fù)合物，具有很強(qiáng)的結(jié)合在陰離子交換柱上的傾向，因此可以采用離子交換層析的方法加以去除.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，最終將融合蛋白中的protein A降到了49.8 ng/mg.

融合蛋白中的另一個(gè)雜質(zhì)為宿主細(xì)胞 DNA.由于 DNA帶有負(fù)電荷，可強(qiáng)烈的結(jié)合陰離子交換柱，因此本實(shí)驗(yàn)采用在陽(yáng)離子交換層析中讓其隨洗脫液穿透，在陰離子交換中讓其吸附的方法，將雜質(zhì) DNA從融合蛋白中去除.從結(jié)果來(lái)看降到了2.3 ng/mg以下，得到了有效去除.此外通過(guò)離子交換，CHOP也得到了進(jìn)一步的去除，降到了3.2 ng/mg以下，達(dá)到了國(guó)家藥典的標(biāo)準(zhǔn)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜0.05%).

圖5 重組蛋白的native-PAGE電泳Fig.5 Native-PAGE of fusion protein

按照 1.10節(jié)的方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行 Native-PAGE，考察其聚集程度，結(jié)果見(jiàn)圖 5.從圖中可以發(fā)現(xiàn)，融合蛋白的條帶要比單純的 HIR MAb條帶遷移速度快，這主要是由于β-NGF作為一種陽(yáng)離子性多肽，增加了融合蛋白的正點(diǎn)性，導(dǎo)致條帶的電泳速度要大于單純的HIR MAb.采用NIH-Image軟件對(duì)融合蛋白的條帶進(jìn)行掃描分析，結(jié)果顯示融合蛋白中只有3.51%發(fā)生聚集，其余的96.48%以單分子的形式存在，說(shuō)明三步法純化工藝不會(huì)導(dǎo)致融合蛋白的聚集，是一個(gè)優(yōu)良的純化工藝.

3 結(jié) 論

(1) 通過(guò)亞克隆的手段將β-NGF片段插入到HIR MAb載體上，并轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞，成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株.

(2) 經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，采用三步法純化工藝對(duì)融合蛋白進(jìn)行了純化，蛋白收率為47.0%.

(3) 蛋白經(jīng)純化后，雜質(zhì) DNA含量可降低到2.3 ng/mg以下，CHOP蛋白降到了3.2 ng/mg以下，protein A蛋白可降低到49.8 ng/mg；96.48%的融合蛋白以單分子的形式存在；

(4) 該純化工藝簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，生產(chǎn)成本低，質(zhì)量檢驗(yàn)方法穩(wěn)定可靠，為大規(guī)模生產(chǎn) HIR MAb-β-NGF融合蛋白提供參考.

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Expression of β-NGF Fusion Protein and Purification by Three Steps Column Chromatography Technology

ZHANG Wen-jun，ZHANG Yu-feng
(School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

CHO cells expressing HIR-β-NGF fusion protein were cultured in serum free medium，then the supernate was collected and purified with a three-step purification process：affinity chromatography，cation exchange chromatography and anion exchange chromatography following concentration and filtering pretreatment；its quality was controlled by Fc ELISA，CHOP ELISA，Western-blot，etc. Experimental results show that the fusion protein relative molecular mass is about 190 kDa；protein recovery is 47.0%；DNA impurities decrease below 2.3 ng/mg；CHOP decreases below 3.2 ng/mg and Protein A decreases to 49.8 ng/mg；only 3.51% fusion protein aggregates；western blot analysis shows HIR- β-NGF kept biological activity. In conclusion，high recovery and purity are acquired and the purification process is stable and reliable，which could provide reference for large-scale production.

nerve growth factor；human insulin receptor；fusion protein；ferment and purification techniques；quality control

TQ464.7

A

0493-2137(2010)11-1031-06

2010-04-29；

2010-06-08.

張文?。?980— ），男，博士研究生.

張文俊，tjzhangwenjun@163.com.