羅 璠

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

乳酸菌分布廣泛，是存在于人、畜腸道中的一種有益微生物。許多乳酸菌都能產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫以及乳酸菌素等化合物，這些物質(zhì)在抑制多種病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要意義，不僅可抑制與其親緣關(guān)系相近的乳酸菌，而且對(duì)非乳酸菌的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也具有一定的抑制作用。因此，乳酸菌在醫(yī)藥、食品及飼料工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。

本試驗(yàn)以分離自豬腸道的動(dòng)物乳桿菌T12為試驗(yàn)材料，測(cè)定其發(fā)酵液中各種化合物的抑菌效果，為開(kāi)發(fā)新的食品添加劑及微生物飼料添加劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品菌株 動(dòng)物乳桿菌T12，分離自豬腸道，能夠產(chǎn)生乳酸菌素。

1.2 指示菌 大腸桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌，溶壁微球菌，黃曲霉，禾谷鐮刀霉，米曲霉，保加利亞乳桿菌，嗜酸乳桿菌，異常漢遜酵母。

以上菌株均由四川省資源微生物與微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基 改良MRS培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺 2.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.58g，Mn2SO4·H2O 0.25g，瓊脂 15.0g，蒸餾水 1.0L，pH值自然；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

2 試驗(yàn)方法

2.1 發(fā)酵液制備 將保存的動(dòng)物乳桿菌T12菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃活化24h，再轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)48h，8000r/min離心，取發(fā)酵上清液放冰箱中備用。

2.2 發(fā)酵液pH值的測(cè)定 用pH儀準(zhǔn)確測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

2.3 發(fā)酵液的抑菌譜研究 采用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)各指示菌的抑菌作用，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每種指示菌做三次重復(fù)。

2.4 酸影響的排除及排酸后發(fā)酵液的抑菌效果 用乳酸調(diào) MRS液體培養(yǎng)基的 pH 值至 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，分別測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果，確定對(duì)照pH值。

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將發(fā)酵液的pH值調(diào)至對(duì)照pH值，測(cè)定該發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑制作用，每種指示菌做三次重復(fù)，以乳酸調(diào)MRS液體培養(yǎng)基至相同pH值為對(duì)照。

2.5 過(guò)氧化氫影響的排除及其對(duì)抑菌效果的影響H2O2對(duì)熱不穩(wěn)定，80℃水浴10 min可以完全除去H2O2。將除酸后的試驗(yàn)菌株發(fā)酵液在80℃水浴10min，測(cè)定其抑菌譜。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 發(fā)酵液的pH測(cè)定 用pH儀測(cè)定動(dòng)物乳桿菌發(fā)酵液的pH值為3.69。

3.2 抑菌譜測(cè)定 采用牛津杯法測(cè)定動(dòng)物乳桿菌T12發(fā)酵液對(duì)不同指示菌的抑制效果，結(jié)果表明，發(fā)酵液對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、乳酸菌均有一定的抑菌效果，對(duì)黃曲霉和米曲霉也有一定的抑制作用。詳見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵液的抑菌譜

3.3 排除酸影響后的發(fā)酵液的抑菌譜 乳酸對(duì)指示菌的抑制效果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，乳酸在pH 4.5時(shí)對(duì)兩種指示菌的抑菌效果已經(jīng)很弱了，在pH 5.0時(shí)抑菌效果完全消失。根據(jù)參考文獻(xiàn)，選擇pH 5.0作為對(duì)照pH值。

調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至5.0后，發(fā)酵液的抑菌譜較調(diào)酸前有一定的變化，說(shuō)明有機(jī)酸起到了一定的抑制作用。除酸后發(fā)酵液仍有抑菌效果，說(shuō)明發(fā)酵液中除了有機(jī)酸還有其他抑菌物質(zhì)存在。根據(jù)研究報(bào)道，其中的乳酸菌素可能是重要的抑菌物質(zhì)之一。

表2 乳酸對(duì)指示菌的抑制效果

表2 排酸后發(fā)酵液的抑菌譜

3.4 除過(guò)氧化氫后的發(fā)酵液的抑菌譜 試驗(yàn)結(jié)果顯示，除去過(guò)氧化氫后的發(fā)酵液的抑菌譜與除酸后的發(fā)酵液的抑菌譜沒(méi)有變化。說(shuō)明過(guò)氧化氫在本試驗(yàn)菌株的發(fā)酵液中沒(méi)有起到明顯的抑制作用。根據(jù)報(bào)道，過(guò)氧化氫有一定的抑菌作用，而在本試驗(yàn)中沒(méi)發(fā)現(xiàn)其明顯的抑制作用，可能是因?yàn)樗诎l(fā)酵液中的含量較少，也可能是因?yàn)槠渌志镔|(zhì)的抑菌效果掩蓋了過(guò)氧化氫的抑制作用。

4 結(jié)論

乳酸菌的抑菌活性往往是其代謝產(chǎn)生的酸、過(guò)氧化氫及細(xì)菌素類(lèi)物質(zhì)所產(chǎn)生的作用。本試驗(yàn)所采用的動(dòng)物乳桿菌T12的發(fā)酵上清液有較強(qiáng)的抑菌活性，在排除酸作用后，對(duì)指示菌仍有較強(qiáng)抑制作用，而過(guò)氧化氫的抑菌效果不明顯。說(shuō)明動(dòng)物乳桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸和乳酸菌素對(duì)多種微生物有明顯的抑制作用，兩者共同作用的抑菌效果明顯強(qiáng)于乳酸菌素的單獨(dú)作用。過(guò)氧化氫在此次試驗(yàn)中的抑菌作用不明顯。

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