成薇婷 胡作為 田德英

1武漢市第一醫(yī)院腫瘤科,武漢 430022

2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院感染科,武漢 430030

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生是多步驟、多階段的過程,由多種基因參與,涉及多條信號通路,發(fā)病機制目前仍不清楚[1]。Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎發(fā)育、組織極性的調(diào)控過程中起重要的決定因素,具有高度保守性。長期以來,研究人員推測與胚胎發(fā)育關(guān)系密切的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在癌變過程中具有重要的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn),Hh信號通路的異常持續(xù)激活和目的基因的過度表達會導(dǎo)致諸如前列腺癌、基底細胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及胃癌等多種惡性腫瘤[2]。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)[3],在HCC組織中Hh信號通路活性異常增強,但具體機制尚不清楚,本研究通過檢測 Hh信號通路的重要組分——信號肽Shh、Ihh、膜受體 Ptch-1 、Smo、轉(zhuǎn)錄因子 Gli-1、Gli-2、Gli-3在各種肝癌細胞株中的表達活性,并分析Hh通路與Snail蛋白之間的關(guān)系,初步探討Hh信號通路與肝癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲之間的關(guān)系,為進一步研究肝細胞癌的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人肝細胞株 L02和人肝癌細胞株 HepG2、Hep3B、SMCC-7721和 Huh-7均購自武漢大學(xué)典型生物保藏中心,于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng),每 48 h更換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司),Trizol、引物(Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、核酸分子量DNA Marker(MBI Fermentas公司),TaqDNA 酶(TaKaRa公司),抗Snail多克隆羊抗、抗Gli-2多克隆兔抗(Santa Cruz公司),蛋白提取試劑盒(Panomics公司),ECL發(fā)光試劑(Pierce公司),其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。PCR擴增儀(ABI公司),蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽(Bio-rad公司),Image Master VDS凝膠掃描儀及圖像分析系統(tǒng)(Pharmacia Biotech公司),PCR基因擴增儀PE9600(PE公司)。

1.3 RT-PCR檢測

常規(guī)收集生長 72 h的 L02、HepG2、Hep3B、SMCC-7721和Huh-7細胞,用 Trizol抽提,氯仿、異丙醇和乙醇等制備總RNA,UV2201型紫外分光光度計測定A260/A280值在1.8～2.0之間。分別取各組總RNA 1 μ L,在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下于37℃合成cDNA。應(yīng)用Premier primer 5.0軟件設(shè)計 Shh 、Ihh 、Ptch 、Smo、Gli-1 、Gli-2、Gli-3、GAPDH引物序列,由Invitrogen公司合成以及純化(表1)。按照試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Design of RT-PCR primers

1.4 Western blot檢測

采用M-PERTM試劑盒提取新鮮組織蛋白,取20 μ g蛋白進行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,BSA封閉2 h后加入一抗(1∶200)4℃孵育過夜,洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h,常規(guī)洗膜,ECL熒光顯色系統(tǒng)檢測,X線片感光顯影,掃描分析各蛋白條帶結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

有人感慨：如果說下水道代表著一座城市的良心，那么報刊亭就是城市文化的“唱詩班”。傳承城市文脈，報刊亭的作用不容小覷。城市不能沒有報刊亭，城市需要更加美好的報刊亭。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

Hh信號通路是一經(jīng)典的胚胎發(fā)育和分化信號系統(tǒng),近年來研究發(fā)現(xiàn)該信號的異常激活在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用,但是Hh信號在HCC中的作用尚不清楚。

2.2.1 Snail的表達情況 在肝癌細胞株SMMC-7721細胞中,Snail蛋白表達量較高,但在永生化正常肝細胞L02中,Snail處于低表達狀態(tài)(圖2),兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

海島是我國海洋國土的重要組成部分，也是海洋經(jīng)濟發(fā)展及國防建設(shè)的重要基點。海島工業(yè)污染源較少，生活垃圾和生活污水是海島的主要污染來源；隨著海島的開發(fā)和建設(shè)大力推進，生活垃圾和污水產(chǎn)量日益增加[1-3]。海島生活垃圾處理方式和設(shè)施的選擇，必須根據(jù)海島生活垃圾產(chǎn)生現(xiàn)狀和理化特征等基本資料和實際情況進行設(shè)計。國內(nèi)對生活污染源的研究主要集中于內(nèi)陸農(nóng)村地區(qū)，海島地區(qū)生活污染物排放規(guī)律、理化特性研究較少。我國海島大部分面積較小，多為村鎮(zhèn)級海島。筆者以廣東省2個村鎮(zhèn)級海島(外伶仃島、東澳島)為研究地點，對生活垃圾產(chǎn)生量、理化特性和生活污水排放系數(shù)、污染物濃度進行研究。

2.1.4 Gli mRNA的表達情況 Gli-1 mRNA在SMMC-7721細胞和Hep3B細胞中的表達顯著強于 L02細胞,均是其的 2.9倍(P＜0.01),在HepG2細胞的表達量較 L02細胞低(P＜0.01),Huh-7細胞的表達量與 L02細胞無明顯差異(P＞0.05);Gli-2 mRNA在L02細胞中幾乎不表達,但在4種肝癌細胞系中均呈現(xiàn)較高表達,特別是在SMMC-7721細胞中,表達強度尤為顯著,各組表達量與L02細胞相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)(圖1B);Gli-3 mRNA在所有的肝細胞系中表達強度相似,均較弱,提示在肝癌細胞中該轉(zhuǎn)錄因子的活性很低。見圖1。

2.1.1 Hh mRNA的表達情況 在5種肝細胞系中Shh mRNA表達程度均較強,其中 Huh-7、SMMC-7721、Hep3B細胞中Shh mRNA的表達強度均高于L02細胞,分別是L02細胞的3.5倍、3.0倍、1.8 倍(均 P ＜0.01,圖 1),而 HepG2中 Shh mRNA的表達量與L02相近(P＞0.05)。Ihh在所測的5種肝細胞系中,表達均較弱(圖1)。

2.1.3 Smo mRNA的表達情況 Smo mRNA在SMMC-7721細胞中表達量最高,其次是HepG2和Hep3B細胞,分別是L02細胞表達量的3.7倍、3.0倍和2.3倍(均P＜0.01),而Huh-7中Smo mRNA的表達則低于永生化細胞L02(圖1)。

2.1.2 Ptch-1 mRNA的表達情況 Ptch-1既是Hh信號肽的膜受體,又為Hh信號通路的目的基因,其表達強度在一定程度上可以代表Hh信號的活性程度。在5種肝細胞系中,Ptch-1 mRNA均有強度不等的表達,其中以SMMC-7721細胞表達強度最高,是L02細胞的2.8倍,在Hep3B細胞的表達也是L02細胞的1.8倍(均 P＜0.01)(圖1)。

2.2 Western blot結(jié)果

控制器主要負責幫助應(yīng)用程序穩(wěn)定運行及接受瀏覽器的終端的請求。控制器在各個層面中間的工作、把控應(yīng)用程序各個環(huán)節(jié)以及處理具體事件方面做出相應(yīng)。其中的事件包含用戶個人行為與信息模型上發(fā)生的變化。它接受廣大用戶的輸入并通過模型與視圖去滿足用戶的需求，當用戶點擊網(wǎng)絡(luò)頁面中的地址或是傳送HTML表格時，控制器不進行任何指令，只是單純的接受請求并決定使用哪個模型組件去處理網(wǎng)絡(luò)端口傳來的請求。隨后在進一步?jīng)Q定用哪個視圖來呈現(xiàn)模型處理返回的信息。

2.2.2 Gli-2的表達情況 與mRNA表達情況一致,Gli-2蛋白在正常肝細胞株L02中的表達極其微量,而在肝癌細胞株SMMC-7721中,Gli-2的表達量異常增高(圖2),兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Spearman秩相關(guān)分析顯示,在SMMC-7721與L02兩種肝細胞中,Gli-2與Snail蛋白表達具有相關(guān)性(r=0.503,P＜0.05)。

圖2 Western blot檢測Snail和Gli-2在L02與SM MC-7721細胞株中的表達差異Fig.2 Differentrial expression of Snail and Gli-2 gene in L02 and SMMC-7721 cells

3 討論

4種肝癌細胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh-7和永生化肝細胞系L02中,Hh信號通路的重要組成成分信號肽Hh(Shh、Ihh)、膜受體(Ptch、Smo)與轉(zhuǎn)錄因子 Gli(Gli-1、Gli-2、Gli-3)的 mRNA均有不同程度的表達(圖1)。

Hh信號通路有3個同源基因,分別是 Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和 Desert hedgehog(Dhh),其受體是跨膜蛋白 Ptch。當Hh不存在的時候,Ptch和Smo組成受體復(fù)合物。當Hh與Ptch結(jié)合后,Smo被激活,并將信號下傳,激活轉(zhuǎn)錄因子 Gli(Gli-1、Gli-2、Gli-3),后者進入細胞核,啟動下游目的基因的表達[2]。Hh信號通過Gli不僅調(diào)控細胞的生長、增殖與分化,也參與了腫瘤細胞的增殖和擴散。研究表明,Shh[4-8]或Ihh[9]信號的異常激活可以引起多種腫瘤的形成和發(fā)展,如神經(jīng)管細胞瘤、小細胞肺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌以及食管癌等。Ptch是Hh信號肽的膜受體,與Hh蛋白結(jié)合后,促進信號的下傳并激活下游一系列因子,同時Ptch與Gli一樣,也是Hh信號通路的目的基因,其表達水平反映了信號通路的活性程度。Berman等[5]采用定量RT-PCR的方法檢測了 15例胰腺癌標本,發(fā)現(xiàn)Ptch mRNA在胰腺癌組織的表達水平是鄰近正常組織的448倍。同樣,在胰腺癌細胞系中也發(fā)現(xiàn)了 Ptch表達的增強[6]。Ma等[10]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌中存在Ptch和Gli-1的過表達,利用特異性抗體阻斷Shh信號通路后,能抑制5種胃癌細胞的生長。Regl等[11]檢測了21例基底細胞癌標本,發(fā)現(xiàn)Gli-2的水平是正常角質(zhì)細胞的2～67倍,并且與Gli-1相互促進表達有助于基底細胞癌的發(fā)生。

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗、χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

付玉看看天。天上有幾只鳥雀飛過，像刀片在她記憶里劃了一道黑色的弧線。馬路兩邊的老槐樹上，有蟬在叫，叫聲像白花花的魚鱗，瓦片般在地上滾動。

在成熟的正常肝細胞中Hh信號通路處于抑制狀態(tài)[5],我們發(fā)現(xiàn)在4種肝癌細胞株中,與永生化胎肝細胞L02相比,Hh信號通路各組成分子中Shh、Ptch 、Smo 、Gli-1 、Gli-2 的表達大多顯著上調(diào) ,說明肝癌細胞的Hh信號通路活性增強。Shh表達活性增高,而Ihh的表達量很低,提示在HCC中,Hh信號通路是以Shh為主要的信號配體。SMMC-7721細胞是具有較高惡性程度和轉(zhuǎn)移活性特征的細胞株,與其他惡性程度和轉(zhuǎn)移活性較低的肝癌細胞株相比,Hh通路活性異常增強,這提示Hh信號通路的激活可能與肝癌細胞的分化、增殖能力以及侵襲力密切相關(guān)。最為顯著的是,在Hh的各種組成分子中,轉(zhuǎn)錄因子Gli-2在SMMC-7721細胞中的表達異常顯著,而L02幾乎不表達Gli-2,說明在肝癌細胞中,Hh信號通路通過Gli-2激活下游的目的基因的轉(zhuǎn)錄,此現(xiàn)象與我們在臨床標本中的檢測結(jié)果一致,并進一步驗證了Hh信號通路,特別是核轉(zhuǎn)錄因子Gli-2與HCC的惡性程度密切相關(guān)。

上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transtions,EMT)是惡性腫瘤細胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中重要生物學(xué)現(xiàn)象,其特征是細胞ECad、α、β、γ-連環(huán)素等上皮細胞標志物表達降低或消失,FSP1、波形蛋白、α-SMA和 N-連環(huán)素等多種間充質(zhì)細胞標志蛋白表達,且侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。Snail是一種編碼鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄因子,參與了乳腺癌、卵巢癌、鱗狀上皮細胞癌、非小細胞肺癌等腫瘤細胞發(fā)生EMT并促進其侵襲轉(zhuǎn)移。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn),Snail不僅可通過下調(diào)E-cadherin表達降低細胞黏附力,還可通過上調(diào)MMP-2、MMP-9表達增加肝癌細胞的侵襲能力,誘發(fā)EM T,促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。利用特異性阻斷劑Cyclopamine阻斷胰腺癌細胞中Hh信號通路,可下調(diào)Snail表達,顯著抑制細胞轉(zhuǎn)移侵襲力[13]。本實驗中,SMMC-7721細胞為具有較強侵襲轉(zhuǎn)移特性的肝癌細胞株,其Hh信號通路活性最強。為了進一步明確Hh是否參與了肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移,我們利用Western blot檢測了 Snail和Gli-2蛋白在SMMC-7721和 L02兩種細胞中的表達情況。結(jié)果顯示,在 SMMC-7721細胞中Gli-2的蛋白表達水平顯著增高,而L02細胞中Gli-2僅有極微弱表達。與此相同的是,Snail蛋白在SMMC-7721細胞中表達量也顯著高于L02細胞,且相關(guān)性分析顯示,Gli-2的蛋白表達與Snail呈正相關(guān)。已知 Hh信號通路可以激活Snail,這提示在肝癌細胞中,異常激活的Hh信號通路可能通過增強Gli-2活性,激活了其下游的目的基因Snail,從而使肝癌細胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲的能力,易于向周圍組織擴散或轉(zhuǎn)移。

經(jīng)過多年研究，特別是近10年的攻關(guān)和示范，我國二氧化碳驅(qū)油埋存基礎(chǔ)理論研究和工程技術(shù)有了重大進展，形成了二氧化碳混相驅(qū)、非完全混相驅(qū)室內(nèi)試驗評價、氣驅(qū)方案設(shè)計、全過程數(shù)值模擬實時跟蹤及調(diào)整技術(shù)、二氧化碳分層注采集輸工藝技術(shù)、二氧化碳腐蝕與防護技術(shù)、二氧化碳綜合監(jiān)測和風險控制技術(shù)、驅(qū)油及埋存選址和容量評估等技術(shù)，為大規(guī)模推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

綜上所述,Hedgehog信號通路在肝癌細胞中的異常激活提示該通路在HCC的發(fā)病機制中可能起到了重要的作用,積極探討Hh信號通路對HCC的影響,對HCC的早期診斷和治療具有深遠的意義。

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