胡 敏 張凱倫 項飛翔

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 1心臟外科 2超聲影像科,武漢 430022 3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心胸外科,武漢 430030

靜脈橋再狹窄是影響冠狀動脈旁路移植(coronary artery bypass graft,CABG)術后遠期療效的主要因素。目前研究表明,血管平滑肌細胞的增殖、移行是血管再塑和重排,并最終導致移植靜脈再狹窄或閉塞的細胞學基礎[1]?；蛑委熥鳛橐环N在分子水平干擾和糾正疾病的治療手段,在移植靜脈橋再狹窄的防治上有良好的應用前景。研究表明超聲輻照結合微泡造影劑可促進裸質(zhì)粒進入細胞中[2-3]。本研究運用微泡造影劑結合超聲輻照介導增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP)轉染移植靜脈,探討該方法的有效性、可行性,為臨床預防CABG術后再狹窄的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠40只,清潔級,體重200～250 g,雄性,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供,許可證號:SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.2 質(zhì)粒提取 pEGFP菌液由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦科腫瘤實驗室朱濤博士提供,pEGFP經(jīng)大腸埃希菌擴增后,按質(zhì)粒大量抽提試劑盒(美國Qiagen公司)說明提取。提取純化的pEGFP酶切電泳鑒定,紫外分光光度計測定其濃度為 1 mg/mL,A260/A280＞1.8。

1.1.3 微泡造影劑 微泡造影劑Sono Vue(意大利Bracco公司產(chǎn)品),主要成分為六氟化硫(SF6)氣體和白色凍干粉末。使用時將5 mL生理鹽水注入Sono Vue藥瓶中,用力振蕩使藥物混合均勻,微泡造影劑濃度為(1～2)×109微泡/mL,微泡直徑2～6 μ m 。

1.1.4 超聲照射系統(tǒng) 美國ACUSON公司的Sequoia 512,選用15L8W探頭。特制輻照容器:聚乙烯管,長約1.5 cm,直徑2 cm,表面以聚乙烯薄膜封口。

1.1.5 熒光顯微鏡 Nikon 80i熒光顯微鏡:激發(fā)波長490 nm,接收波長530 nm。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和模型建立 動物隨機分4組(10只/組),即A 組:單純質(zhì)粒浸泡組;B組:質(zhì)粒+微泡造影劑組;C組:質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組;D組:質(zhì)粒+微泡造影劑+超聲輻照組。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫18～25℃,濕度65%～70%,自由飲水進食。動物模型建立:大鼠以10%水合氯醛水溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,同時腹腔注射肝素10 U/100 g,作右側頸部縱切口,取頸外靜脈段約2.0 cm,以間斷縫合法間置植于頸總動脈,建立頸外靜脈頸總動脈旁路移植模型。術后當天肌肉注射青霉素20萬單位,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒與微泡造影劑混合液的配制 一次性注射器抽取5 mL生理鹽水,注入Sono Vue微泡造影劑安瓿中,充分搖勻備用;取pEGFP溶液1 mL(質(zhì)粒濃度1 mg/mL),將其加入上述造影劑安瓿中,搖勻后4℃下靜置30 min,使pEGFP充分粘附于微泡的外殼。

1.2.3 超聲輻照 取大鼠頸外靜脈段長約 2.0 cm,將靜脈段置入含有相應液體的特制輻照容器中,小心以聚乙烯薄膜封口,盡量不留可見氣泡,給予超聲輻照或僅將探頭置于容器上不開啟超聲儀器(超聲探頭與聚乙烯薄膜之間以耦合劑密閉)。輻照參數(shù):探頭頻率固定為10 MHz,機械指數(shù)為1.9,輻照時間為10 min。動物隨機分為上述4組各10只,將處理后的靜脈段間置吻合于頸總動脈,建立頸外靜脈頸總動脈旁路移植模型。待大鼠蘇醒后送回動物房常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2.4 觀察報告基因的表達 轉染 pEGFP 7 d后,取出移植靜脈段,經(jīng)固定劑固定15 min后置于恒冷箱切片機凍臺上行冷凍切片,將組織橫切為厚度為7 μ m的薄片。使用Nikon 80i熒光顯微鏡在490 nm波長紫外光激發(fā)下觀察報告基因在靜脈組織中的表達。每張切片隨機取5個視野,每個視野取3個熒光強度最亮的區(qū)域作熒光強度比較。數(shù)據(jù)采集由NIS-Elements BR(Nikon)軟件完成。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察報告基因pEGFP的表達

轉染pEGFP質(zhì)粒7 d后,D組可見明顯特異性綠色熒光,主要位于血管平滑肌層,C組也有少量的表達;而A組和B組則無表達(圖1)。同時對各組血管組織進行了蘇木精-伊紅染色,沒有發(fā)現(xiàn)任何形式的壞死出現(xiàn)(圖2)。

圖1 熒光顯微鏡觀察報告基因pEGFP的表達Fig.1 The expression of pEGFP in vascular smooth muscle cells examined by fluorescence microscopy

圖2 質(zhì)粒+微泡造影劑+超聲輻照組血管組織蘇木精-伊紅染色(×200)Fig.2 Vascular tissue hematoxy lin-eosin(HE)staining in plasmid+microbubble contrast agents+irradiation group(g roup D)(×200)

2.2 各組綠色熒光強度比較

A組熒光強度為(2.20±0.25),B組為(3.35±0.73),C組為(13.23±1.55),D組為(45.78±5.81)。D組pEGFP的熒光強度顯著高于其他各組(均 P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組間熒光強度比較Fig.3 Comparison of fluo rescence intensity among the four groups

3 討論

CABG是目前治療缺血性心臟病的重要手段,人體大隱靜脈(human saphenous vien,HSV)具有取材容易、長度充分、口徑大易吻合等優(yōu)點,目前仍是冠狀動脈搭橋術中常用的一種血管材料。然而HSV的遠期通暢率卻較動脈橋低,其術后第1年阻塞率為15%,之后阻塞率逐年遞增1%～4%,10年通暢率僅60%左右[4]。CABG術后靜脈橋再狹窄是影響冠心病治療效果的一個決定性因素?？刂苾?nèi)膜和平滑肌增生、防治血管損傷后再狹窄是當今世界多個學科共同研究的重要課題。CABG手術中,患者的大隱靜脈被暫時性取出體外,為有效的靶向基因治療提供了一個獨特的時機。如何將外源基因高效地轉入靜脈組織中是目前基因治療研究的一個熱點。

目前將外源性基因轉染入靶細胞的方法主要有病毒載體轉染與非病毒載體轉染兩大類,前者具有較高的轉染效率,但存在免疫反應、細胞毒性與安全性等問題;而后者具有安全、簡單的優(yōu)勢,但存在轉染效率低的弱點。超聲微泡型造影劑由于其特殊的構造,能有效吸附基因載體。國內(nèi)外近年的研究表明,微泡造影劑可以作為一種新型的基因載體,具有減少降解、具備靶向性,并兼有明顯提高透膜轉染率的特點[5-6]。其基本原理為:聲場內(nèi)的超聲波破壞微泡造影劑后,其產(chǎn)生的空化和機械效應一方面引起微循環(huán)結構改變,導致血管內(nèi)皮細胞間隙增寬,另一方面可導致短暫的細胞多孔化,使細胞膜通透性增加[7-8]。有研究顯示:微泡強化的空化作用可顯著提高體外培養(yǎng)細胞的基因轉染水平約300倍[9]。

本研究以Sono vue作為EGFP基因載體,結合靶組織的超聲輻照,熒光顯微鏡下顯示移植靜脈橋組織細胞內(nèi)EGFP明顯多于質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組;而單純pEGFP組及單純質(zhì)粒+微泡組不進行超聲輻照時未見EGFP表達,這2組間差異無統(tǒng)計學意義,說明單純微泡本身在基因轉染中并不發(fā)揮直接作用,而是結合了超聲輻照才可有效增加細胞膜的通透性,提高基因的轉染效率。同時對輻照后的血管組織進行了蘇木精-伊紅染色,沒有發(fā)現(xiàn)任何形式的壞死出現(xiàn),這提示在此條件下的超聲輻照及其破壞微泡所產(chǎn)生的各種效應并未對血管組織產(chǎn)生致死性損傷,這為將來此種方法的臨床應用提供了安全的保證。

本研究表明超聲輻照結合微泡造影劑能有效提高基因在移植靜脈中的轉染,且相對安全,有望在為移植靜脈再狹窄的基因防治中發(fā)揮作用。但本研究僅以報告基因為研究對象,欲真正實現(xiàn)基因治療尚須大量細致的研究。

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