葛 鋒,王劍平,王曉東,趙 兵,王玉春

1昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院,昆明 650224;2中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100080

新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.)為紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物,其根藥用,有效藥用成分是紫草素及其衍生物,這些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用,而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印染工業(yè)中[1??！吨腥A人民共和國藥典》收錄的中藥紫草中,以新疆紫草品質(zhì)最佳[2?,為主要的商品藥用紫草。目前,新疆紫草的野生資源破壞嚴重,自然生態(tài)環(huán)境惡化,而旺盛的市場需求凸顯了供需矛盾。從長遠考慮,通過細胞的大規(guī)模培養(yǎng)直接生產(chǎn)紫草素來滿足藥用需求是比較有潛力的途徑。

國內(nèi)外對新疆紫草細胞和組織培養(yǎng)的研究主要集中在愈傷組織的誘導、愈傷組織培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及各種物理、化學或生物刺激因子對新疆紫草細胞有效次生代謝產(chǎn)物的影響研究等方面[3,4?。我們已經(jīng)對新疆紫草愈傷組織的誘導條件[5?、稀土元素和超聲波對新疆紫草細胞生長和藥用次生代謝產(chǎn)物積累等進行了研究[6,7?。植物細胞懸浮培養(yǎng)過程中,營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累、細胞的生長速率是植物由搖瓶培養(yǎng)放大到生物反應(yīng)器培養(yǎng)的關(guān)鍵參數(shù)。而生物反應(yīng)器技術(shù)是實現(xiàn)植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵工業(yè)化技術(shù)。本文對新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)過程進行了研究,為新疆紫草細胞生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

將由外植體誘導得到的新疆紫草愈傷組織[5?,在液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),得到分散的新疆紫草細胞及聚集體。葡萄糖、硝酸鉀和硝酸銨等化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

2.2.1 新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)方法

前期研究表明[5-7?,新疆紫草細胞中紫草素的生物合成屬非生長偶聯(lián)型,而且細胞生長和紫草素合成所使用的培養(yǎng)基也不同,因此采用二步培養(yǎng)法,把細胞生長階段和紫草素合成階段分開單獨進行研究。新疆紫草細胞生長的懸浮培養(yǎng)采用 N6培養(yǎng)基[7?,接種量為 2%;紫草素合成的懸浮培養(yǎng)采用M 10培養(yǎng)基[7?,接種量為 7.5%。所有實驗均在裝有 40m L液體培養(yǎng)基的 100mL三角瓶中進行。N6培養(yǎng)基中添加 1mg/L KT。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,搖床轉(zhuǎn)速 120 r/min,暗培養(yǎng)。細胞生長的培養(yǎng)周期為 21 d;紫草素生物合成的培養(yǎng)周期為 16 d。

1.2.2 細胞干重測定方法

取新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)液,用濾紙過濾,將細胞置于烘箱中,55℃烘約 24 h至恒重,稱得其干重即為生物量(g/L)。

1.2.3 紫草素含量測定方法

紫草素在 520 nm處有最大吸收峰。由此可進行標準曲線的繪制,曲線方程為:

C=187.85 OD520nm-2.09,r=0.9995

其中,C為紫草素石油醚溶液中的紫草素濃度(mg/L),OD520nm為該測定溶液的吸光度值。

取新疆紫草細胞培養(yǎng)液,3500 r/min離心 20 min,回收的沉淀物為鮮細胞。將鮮細胞轉(zhuǎn)移至三角瓶中,加入一定量的石油醚(沸點 30～60℃),三角瓶放入超聲場中進行細胞破碎,然后在室溫下振蕩(110 r/min)提取 24 h,提取液用于測定細胞中的紫草素含量(%)[6?。

紫草素產(chǎn)量(g/L)=紫草素含量(%)×細胞干重(g/L)

1.2.4 培養(yǎng)液電導率、pH值的測定

將過濾后的細胞培養(yǎng)液用 DDS-11A型電導率儀測定電導率。pH測定采用 Beckman pH meter。

1.2.5 培養(yǎng)液中 NO-3、NH+4、PO3-4、可溶性糖含量的測定

NO-3含量采用苯酚二磺酸法測定[8?,NH+4含量采用靛定酚藍比色法測定[8?,PO3-4含量采用鉬酸鹽-釩酸鹽試劑測定[8?,可溶性糖含量采用苯酚-硫酸法測定[9?。

2 結(jié)果與討論

2.1 新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)時細胞生長和紫草素合成過程

由于新疆紫草細胞的生長和紫草素的合成屬于非生長耦聯(lián)型,而且細胞生長階段和紫草素合成階段所用培養(yǎng)基成分差異較大,為此,我們把這兩個階段分開單獨進行實驗,以便探究有關(guān)細胞生長和紫草素合成的一些基本情況。

當接種量為 2%時,新疆紫草細胞懸浮培的 0～3 d為細胞生長的延滯期,此階段細胞主要進行初級代謝活動,同時適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境,為即將到來的細胞分裂旺盛期做物質(zhì)上的準備。第 3 d后,細胞生長進入指數(shù)生長期,這個時期細胞分裂速度快,生長活躍,細胞的鮮重和干重都顯著增加,培養(yǎng)到第15 d時,培養(yǎng)體系獲得最大生物量為 12.2 g DW/L。隨后生長曲線很快進入衰亡期,細胞逐漸褐化、死亡。

由于紫草素合成的培養(yǎng)基 M10不適合細胞的生長,所以當接種量為 7.5%時,在整個紫草素合成階段,細胞的生物量只有 1倍左右的增長。但是M10培養(yǎng)基非常適合紫草素的合成,從接種當天開始,細胞就開始迅速合成紫草素,基本上沒有延滯期。紫草素含量迅速增長階段一直持續(xù)到第 12 d,此時獲得了最高的紫草素含量 2.13%和紫草素產(chǎn)量 243.1mg/L,其中紫草素產(chǎn)量比接種時增長達12.2倍。12 d以后,細胞開始衰亡。

2.2 新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)生長階段 pH值和電導率的變化

新疆紫草懸浮培養(yǎng)細胞生長階段 pH值和電導率的變化如圖 1所示。由圖可知,在新疆紫草懸浮培養(yǎng)的整個過程中,pH值的變化不大,大致在 5.2～5.8之間小幅波動,培養(yǎng)后期的 pH值比培養(yǎng)初期略微偏高;培養(yǎng)液的電導率與細胞生物量呈負相關(guān),隨著生物量的增加,培養(yǎng)液的電導率降低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是細胞在生長過程中要吸收大量的無機導電離子作為營養(yǎng)物質(zhì),導致培養(yǎng)液電導率下降,培養(yǎng)到第 15 d時,細胞的生物量達到最大,培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)被最大限度的吸收,導電離子濃度最低,因此表現(xiàn)出電導率下降到最小值,隨后,細胞進入衰亡期,部分種齡大的細胞出現(xiàn)褐化、死亡,衰亡的細胞中釋放出了部分導電離子,使得培養(yǎng)液電導率出現(xiàn)小幅增長。

圖 2為懸浮培養(yǎng)細胞生長過程中第 5～13 d期間,生物量增長和培養(yǎng)液電導率降低的關(guān)系。第 5～13 d為細胞的指數(shù)生長期,細胞生長和增殖處于旺盛期,考察此階段細胞生物量和電導率的相關(guān)性相對整個培養(yǎng)周期而言最具代表性。回歸分析獲得指數(shù)生長期生物量和電導率的關(guān)系式為:C=4525-76.72Y,r=0.999,其中,C為電導率(us/cm),Y為生物量(g.DW/L)。由于電導率的測量比較容易,方便、快捷,因此,利用電導率和生物量之間的良好的線性相關(guān)可以迅速地通過培養(yǎng)液電導率的測定來分析細胞的生長情況,這種間接測定細胞生物量的方法用在生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)過程中具有較高的實際應(yīng)用價值。

2.3 新疆紫草細胞紫草素合成階段 pH值和電導率的變化

由圖 3可知,在新疆紫草懸浮培養(yǎng)的整個過程中,pH值的變化不大,大致在 5.8附近小幅波動;培養(yǎng)液的電導率與紫草素合成量成負相關(guān)。培養(yǎng)過程中的 8～12 d,電導率無明顯變化,而紫草素的合成迅速增加,并在第 12 d達到最大值。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是在紫草素的生成是細胞一系列生理生化反應(yīng)的結(jié)果,這其中必然伴隨有培養(yǎng)液中無機離子的消耗,使得培養(yǎng)液電導率下降;同時當培養(yǎng)時間超過第 8 d時,雖然整個培養(yǎng)體系的紫草素合成量是增加的,但少量種齡較大的細胞開始出現(xiàn)裂解,一些導電離子從細胞中釋放出來,導致培養(yǎng)液的電導率增加。上面兩個對于電導率變化相反的作用過程達到動態(tài)平衡時,培養(yǎng)液中的電導率值將近似保持恒定。新疆紫草細胞在生長培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)時沒有出現(xiàn)一個電導率相對恒定的時間進程(圖1),而在紫草素合成過程中卻有一個電導率變化的平臺期,這可能是因為在細胞生長培養(yǎng)基中(N6培養(yǎng)基),細胞生長旺盛,良好的生長環(huán)境使得細胞發(fā)生程序性凋亡的時間后延,大部分細胞集中在指數(shù)生長期結(jié)束的時候出現(xiàn)裂解、死亡,整個細胞生長周期的進程比較一致,因此沒有電導率恒定期;而在紫草素合成培養(yǎng)基中(M10培養(yǎng)基),培養(yǎng)條件適合紫草素的合成,不利于細胞的生長,培養(yǎng)一段時間后,少部分細胞就出現(xiàn)了群體性死亡,直接導致電導率變化平臺期的出現(xiàn)。

2.4 新疆紫草細胞生長過程中硝酸鹽和可溶性糖的消耗情況

新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)生長階段硝酸鹽和可溶性糖的消耗情況如圖 4所示。新疆紫草細胞生長培養(yǎng)基的碳源為蔗糖,氮源為硝酸鹽和氨鹽,其它的營養(yǎng)物質(zhì)還有鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、硫酸鹽和磷酸鹽等。在培養(yǎng)過程中,蔗糖分解為葡萄糖和果糖,果糖再轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?然后葡萄糖被植物細胞所利用。葡萄糖進入植物細胞后,一部分組成細胞的結(jié)構(gòu)物質(zhì),一部分通過呼吸作用為細胞的生命活動提供能源。培養(yǎng)過程中 NO-3和蔗糖的初始濃度分別為 1737 mg/L和 30 g/L。在 0～15 d,NO-3和蔗糖被細胞逐漸吸收利用,濃度快速下降,第15 d時,NO-3和蔗糖濃度同時達到最小值,NO-3濃度為 457mg/L,被消耗掉約 73%;蔗糖濃度為 12.6 mg/L,被消耗掉 58%,此時與細胞的最大生物量相對應(yīng)。NO-3是細胞生長培養(yǎng)基中的主要氮源供應(yīng)物質(zhì),因此它的消耗情況直接體現(xiàn)了細胞的生長情況。

2.5 新疆紫草細胞生長過程中銨鹽和磷酸鹽的消耗情況

新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)生長階段銨鹽和磷酸鹽的消耗情況如圖 5所示。初始 NH+4和 PO3-4的濃度分別為 126和 279 mg/L。磷酸鹽消耗速度很快,第 9 d時,磷酸鹽已被消耗約 79%;到 15 d時,磷酸鹽的濃度達到最低值,僅為 32.4mg/L,消耗 88%。磷酸鹽的快速吸收可能與細胞生長、分裂時需大量合成核酸物質(zhì)有關(guān)。銨鹽的吸收主要與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成有關(guān),其消耗速度先慢后快,從 0～6 d,僅消耗 11%,在第 15 d,濃度出現(xiàn)最小值 19.1 mg/L,消耗掉約 85%。

2.6 新疆紫草細胞生長過程中的生長速率和比生長速率

細胞生長過程中細胞的生長速率 γY=dY/dt≈△Y/△t,比生長速率 μ=dY/dt? 1/Y≈△Y/△t?1/Y。其中 Y表示細胞濃度(g/L),t表示培養(yǎng)時間(d)。由圖 6可知,在細胞生長的延滯期(0～3 d),細胞的生長速率和比生長速率較低;到了指數(shù)生長期,生長速率和比生長速率迅速增加,其中在第 13 d,生長速率達到最大值 1.2 g/(L?d),在第 7 d比生長速率達到最大值 0.33/d。指數(shù)生長期過后,細胞迅速進入衰亡期,生長速率和比生長速率呈現(xiàn)負增長。

2.7 新疆紫草紫草素合成過程中的合成速率和比合成速率

紫草素合成階段紫草素合成速率為 γp,比合成速率 μp/Y=γp/Y。新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)過程中紫草素合成速率和比合成速率的變化如圖 7所示。由 2.1可知紫草素的合成過程幾乎沒有延滯期,細胞接種后,很快進入合成旺盛期,這種現(xiàn)象在圖 7中的表現(xiàn)就是培養(yǎng)過程前半段紫草素合成速率和比合成速率在高位徘徊,最大值分別出現(xiàn)在第 6 d(28 mg/(L? d))和第 4 d(3.49×10-3/d)。培養(yǎng)到 10 d以后,γp和 μp/Y出現(xiàn)大幅度下滑。由于新疆紫草細胞紫草素的合成屬于非生長耦聯(lián)型,紫草素合成階段使用的培養(yǎng)基并不適合細胞的生長,細胞生物量只有小幅增長,因此在圖 7中,紫草素的合成速率與紫草素的比合成速率相比更能代表培養(yǎng)體系中紫草素的合成規(guī)律。

2.8 細胞收率系數(shù)

構(gòu)成植物細胞的主要物質(zhì)元素為 C、H、O、N、P,細胞培養(yǎng)過程中 C源、N源和 P源轉(zhuǎn)化為細胞物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率相當重要。圖 8表明了細胞生長階段各主要無機元素的濃度與細胞生物量的相關(guān)性。從中可以看出硝酸鹽、銨鹽、可溶性糖與細胞生物量有著良好的線性關(guān)系,線性回歸方程的斜率即為基于底物消耗的細胞收率系數(shù)?；谙跛猁}的細胞收率系數(shù)Yx/n=8.64 g/g;基于銨鹽的細胞收率系數(shù) Yx/a=104.3 g/g;基于可溶性糖的細胞收率系數(shù) Yx/s=0.68 g/g。

磷酸鹽與細胞生物量線性相關(guān)性不好,這可能是因為磷酸鹽在細胞代謝過程中主要用來合成遺傳物質(zhì),而遺傳物質(zhì)的合成常常早于細胞干物質(zhì)的積累過程。從圖 8可以看出磷酸鹽大量消耗的階段,細胞的生物量增加緩慢;而細胞生物量迅速增加的階段,磷酸鹽消耗速度明顯變緩。

3 結(jié)論

通過對新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)過程中生物量、紫草素含量和底物濃度隨時間變化的分析,可以得出細胞懸浮培養(yǎng)的基本情況。新疆紫草細胞的生長和紫草素的合成屬于非生長偶聯(lián)型,新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)的生長階段約為 21 d,其中 0～3 d為細胞生長的延滯期,3～15 d為細胞的指數(shù)生長期,15 d后進入衰亡期;紫草素合成階段約為 16 d,接種后細胞就開始迅速合成紫草素,一直持續(xù)到 12 d,隨后進入平衡期和衰亡期。

新疆紫草細胞生長階段培養(yǎng)液的電導率與生物量呈負相關(guān),隨著生物量的增加,培養(yǎng)液的電導率降低;當細胞進入衰亡期,生物量下降時,電導率增加。由于電導率的測量比較容易,方便、快捷,因此,利用電導率和生物量的這種相關(guān)性可以迅速地通過培養(yǎng)液電導率的測定來預(yù)測培養(yǎng)體系中生物量的變化情況。

培養(yǎng)過程中磷酸鹽消耗最快,硝酸鹽、銨鹽和可溶性糖的消耗與生物量的變化具有很好的線性關(guān)系,從而獲得了基于硝酸鹽、銨鹽和可溶性糖的細胞收率系數(shù)。

1 Huang ZS(黃志紓),Zhang M(張敏),Ma L(馬林),et al.A survey of chemical and pharmacologic studies on Zicao.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2004,12:73-82.

2 Ge F(葛鋒),Wang XD(王曉東),Wang YC(王玉春).Advances in studies onmedicinal Radix Arnebiae Seu Lithospermi.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥),2003,34(9):5-8.

3 Ji QL(計巧靈),Wang WG(王衛(wèi)國).Asexual propagation of Arnebia euchroma Johnston and exploration of hereditary stability in regenerated plantlets.Plant Phys Commun(植物生理學通訊),2001,37:499-502.

4 Ye HC(葉和春),Yin ZH(尹作鴻),Li GF(李國鳳),et al.Effects of physical and chemical factors on callus growth and shikonin derivative formation in the callus cultures of Arnebia euchroma.Acta Botanica Sinica(植物學報),1991,33:927-931.

5 Ge F(葛鋒),Wang XD(王曉東),Wang YC(王玉春).Studies on highly efficient induction of callus from Arnebia euchroma and rapid proliferation of callus.Chin Pharm J(中國藥學雜志),2004,39:735-737.

6 Ge F(葛鋒),Chen CY(陳朝銀),Wang XD(王曉東),et a l.Effects of u ltrasonicwave on cellgrowth and shikonin biosynthesis in suspension culture of Arnebia euchroma.Chin J Process Eng(過程工程學報),2008,8:115-119.

7 Ge F,Wang XD,Zhao B,eta l.Effects of rare earth elements on the grow th of Arnebia euchroma cells and the biosynthesis of shikonin.Plant Grow th Regulation,2006,48:283-290.

8 Chen SA(陳書安).Process regulation in Crocus sativas L.cell and tissue culture.Beijing:Instituteof Process Engineering,CAS(中國科學院過程工程研究所),PhD.2004.

9 Zhang WJ(張惟杰).Biochemical Research Technique of Com plex Am ylose(復合多糖生化研究技術(shù)).Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers,1995.