鄭師明，嚴(yán)鵬科，李世煌，段才聞，吳仲洪，肖國宏#

（1.廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，廣州市 510150；2.湖南郴州市第四人民醫(yī)院心內(nèi)科，郴州市 423000；3.南華大學(xué)藥物藥理研究所，衡陽市 421001）

益母草，《神農(nóng)本草經(jīng)》原名茺蔚，為唇形科益母草屬植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的全草，我國大部分地區(qū)都有分布，具有來源廣、易得到、常規(guī)劑量無毒副作用的特點(diǎn)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，益母草具有擴(kuò)張冠脈、增加冠脈血流、溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低紅細(xì)胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧自由基、減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮子宮、利尿等諸多作用，從而為其用于臨床提供了廣泛的藥理學(xué)基礎(chǔ)[1]。

市售益母草注射液，由于提取工藝和純度等不足，目前國家只批準(zhǔn)用于肌肉注射并用于產(chǎn)后出血。近年有初步研究報(bào)道，其可用于心肌缺血的防治，且療效確切[1]。由于心肌缺血引起的心血管疾病具有發(fā)病快、病情急、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，靜脈注射能較快控制病情，患者易于接受。因此，對可用于靜脈注射的精制益母草生物堿的生產(chǎn)工藝有必要作進(jìn)一步研究。

1 材料

1.1 儀器

石英回流裝置（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超聲提取器（深圳市科工達(dá)超聲設(shè)備有限公司）；SHB2B95型循環(huán)真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海博通化學(xué)科技有限公司）。

1.2 試藥

益母草粗粉（產(chǎn)地安徽）經(jīng)湖南九芝堂藥店鑒定并加工為飲片；水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品（陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號：20080307，含量：＞99%）；水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品ADS-A、ADS-B、ADS-C、ADS-D型制藥用級特制品大孔樹脂（南開合成科技有限公司）；雷氏鹽、無水乙醇、鹽酸、丙酮、鹽酸乙醇等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 超聲提取法

2.1.1 70%乙醇結(jié)合超聲提取：稱取100 g益母草粗粉，置于3000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的70%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡30 min，再超聲40 min，過濾，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.1.2 95%乙醇結(jié)合超聲提?。悍Q取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的95%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡30 min，再超聲40 min，過濾，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.1.3 0.05%鹽酸乙醇超聲提?。杭尤?.05%鹽酸乙醇，提取方法同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2 回流提取法

2.2.1 70%乙醇結(jié)合回流提?。悍Q取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的70%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡10 min，再加熱至70～80℃回流2 h，過濾，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.2.2 95%乙醇結(jié)合回流提?。悍Q取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的95%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡10 min，再加熱至70～80℃回流2 h，過濾，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.2.3 0.05%鹽酸乙醇回流提?。杭尤?.05%鹽酸乙酸，提取方法同“2.2.2”項(xiàng)。

2.3 浸漬提取法

2.3.1 1%鹽酸浸漬法：取100 g益母草粗粉，用8倍體積的1%鹽酸（約3000 mL）在室溫（20℃）浸泡24 h，過濾后將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾（80℃），濃縮至1 mL相當(dāng)于原藥1 g即可（約100 mL），備用。

2.3.2 1%磷酸浸漬法：取100 g益母草粗粉，用8倍體積的1%磷酸（約3000 mL）在室溫（20℃）浸泡24 h，過濾后將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾（80℃），濃縮至1 mL相當(dāng)于原藥1 g即可（約100 mL），備用。

2.4 生物堿的離子交換法純化

2.4.1 樹脂最大吸附量的確定：分別取1 g樹脂加入25 mL 1.72 mg·mL-1的提取液中，調(diào)pH值分別至6、7、8，25 ℃恒溫振蕩，2 h后定量吸取溶液，過濾沉淀，計(jì)算各種上清液中生物堿含量，上樣量與此值的差為理論吸附量或樹脂的靜態(tài)吸附容量。

2.4.2 樣品純化：取最佳優(yōu)化工藝的提取液，調(diào)定pH值，過柱并吸附飽和的大孔樹脂，去離子水洗至中性，10%、30%、50%、70%、90%乙醇依次洗脫，收集每一洗脫液，生物堿沉淀，薄層層析判斷有效成分。有效洗脫成分減壓濃縮，濃縮液以NaOH調(diào)pH至不產(chǎn)生沉淀為止。靜置過夜，離心沉淀物，去離子水洗至中性，干燥，無水乙醇溶解，過濾，減壓濾液濃縮，真空干燥。

2.4.3 檢測：以丙酮為空白，在最大波長510 nm處測各樣本的吸光度（A），再代入公式中計(jì)算生物堿的含量（W＝179.63×10×A/106.5）。水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品用于檢測該方法的準(zhǔn)確度。此試驗(yàn)制備了3個不同濃度的樣品分別測定3次，結(jié)果回收率為100.6%，表明該方法的準(zhǔn)確度達(dá)到要求。

2.4.4 干膏質(zhì)量的測定：將樣品液過濾，精確定容至100 mL，置烘箱中干燥為粉末，稱重。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 精制益母草生物堿提取工藝的篩選

3.1.1 不同溶劑超聲提取對精制益母草生物堿提取率的影響：通過3次對不同批號（20080403、20060504、20060507）藥物原料的提取研究發(fā)現(xiàn)，超聲結(jié)合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中70%乙醇的平均生物堿提取率為0.22%，95%乙醇的提取率為0.29%，0.05%鹽酸乙醇的提取率為0.373%。結(jié)果表明，在超聲法中以0.05%鹽酸乙醇提取的干膏生物堿含量和提取率最高。

3.1.2 不同溶劑回流提取對精制益母草生物堿提取率的影響：通過3次對不同批號藥物原料的提取研究發(fā)現(xiàn)，回流法結(jié)合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中70%乙醇的平均生物堿提取率為0.217%，95%乙醇的提取率為0.303%，0.05%鹽酸乙醇的提取率為0.317%。結(jié)果表明，在回流法中以0.05%鹽酸乙醇提取的干膏生物堿含量和提取率最高。

3.1.3 不同溶劑冷浸提取對精制益母草生物堿提取率的影響：通過3次對不同批號藥物原料的提取研究發(fā)現(xiàn)，冷浸法結(jié)合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中1%鹽酸的平均生物堿提取率為0.410%，1%磷酸的提取率為0.340%。結(jié)果表明，在浸漬法中以1%鹽酸提取的干膏生物堿含量和提取率最高。

3.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化精制益母草生物堿提取工藝

3.2.1 超聲提取法正交設(shè)計(jì)優(yōu)化：結(jié)合實(shí)際情況，做L9（34）正交試驗(yàn)，考慮溶劑濃度、溶劑用量、處理時間、處理次數(shù)4個因素，每個因素取3個水平，設(shè)計(jì)正交表，用雷氏鹽沉淀溶解比色法測定總生物堿含量。結(jié)果表明，超聲提取法最佳提取工藝為溶劑濃度1%，溶劑量8倍，處理60 min，處理1次（具體試驗(yàn)另文發(fā)表）。

3.2.2 回流提取法正交設(shè)計(jì)優(yōu)化：考慮溶劑濃度、溶劑用量、處理時間、處理次數(shù)4個因素，每個因素取3個水平，設(shè)計(jì)正交表，用雷氏鹽沉淀溶解比色法測定總生物堿含量。結(jié)果表明，回流提取法最佳提取工藝為溶劑濃度1.5%，溶劑量4倍，處理60 min，處理3次（具體試驗(yàn)另文發(fā)表）。

3.2.3 浸漬提取法正交設(shè)計(jì)優(yōu)化：考慮溶劑濃度、溶劑用量、處理時間、處理次數(shù)4個因素，每個因素取3個水平，設(shè)計(jì)正交表，用雷氏鹽沉淀溶解比色法測定總生物堿含量。結(jié)果表明，浸漬提取法最佳提取工藝為溶劑濃度1%，溶劑量8倍，處理24 h，處理3次（具體試驗(yàn)另文發(fā)表）。

3.3 精制益母草生物堿純化工藝及其優(yōu)化

3.3.1 不同ADS大孔樹脂對精制益母草生物堿的靜態(tài)吸附作用：在提取液的pH為6～8之間時，4種ADS大孔樹脂對生物堿均有吸附作用。其中，pH值為8時ADS-B的靜態(tài)吸附最強(qiáng)。研究過程中觀察到，當(dāng)提取液的pH值為4、5時，各種樹脂的靜態(tài)吸附很少；pH值為9、10、11時，提取液出現(xiàn)沉淀反應(yīng)，影響過柱效果。不同ADS型號樹脂、pH值對精制益母草生物堿靜態(tài)吸附作用的影響見表1。

表1 不同ADS型號樹脂、pH值對精制益母草生物堿靜態(tài)吸附作用的影響Tab 1 Effect of different ADS macroporous resin and pH on static absorbability of alkaloid of L.japonicus

3.3.2 不同ADS大孔樹脂對精制益母草生物堿的純化作用：不同ADS柱純化精制益母草生物堿的回收效率不同，ADS-C回收生物堿的量最高（以水蘇堿含量為判斷指標(biāo)），但回收物干膏的生物堿含量僅為2.8%；ADS-B回收生物堿的量略低于ADS-C，但回收物干膏的生物堿（以水蘇堿含量為判斷指標(biāo)）含量已達(dá)38.6%，符合國家中藥新藥技術(shù)要求：所測定成分的總含量應(yīng)不低于總固體量的20%（靜脈用不少于25%）。不同ADS型號樹脂對精制益母草生物堿純化作用的影響見表2。

4 討論

益母草的主要化學(xué)成分有生物堿類、二萜類、黃酮類、揮發(fā)油類、微量元素等[1]，其中生物堿類一直被認(rèn)為是益母草的有效成分，用作質(zhì)量控制的指標(biāo)。生物堿類主要包括益母草堿、水蘇堿、益母草啶等。本研究中筆者提取出的精制益母草生物堿，與常規(guī)提取的益母草生物堿比較有更強(qiáng)的抗心肌缺血作用，且無明顯毒副作用（結(jié)果另文發(fā)表）。

表2 不同ADS型號樹脂對精制益母草生物堿純化作用的影響Tab 2 Effect of different ADS macroporous resin on purification of alkaloid of L.japonicus

目前臨床應(yīng)用的益母草制劑的提取工藝一直都采用水提醇沉、濃縮干燥的方法，有效成分得率低，含雜質(zhì)較多，制約了將其進(jìn)一步制成現(xiàn)代化的劑型。因此，研制新型益母草制劑首先需加強(qiáng)益母草提取精制工藝研究。

超聲提取法是一種簡便、不需加熱、提取時間短的現(xiàn)代中藥提取方法[2]，適用于固體制劑中測定組分的提取，應(yīng)用日益廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，超聲結(jié)合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中溶劑A的平均生物堿提取率為0.220%，溶劑B的提取率為0.290%，溶劑C的提取率為0.373%。在超聲法中，以溶劑C的提取干膏生物堿含量和提取率最高。

回流提取法克服了一般的冷浸、煎煮等法因提取時間長影響提取率的缺點(diǎn)，利用有機(jī)溶劑的相似相溶原理，用不同濃度的溶劑進(jìn)行回流提取，再用雷氏鹽比色法進(jìn)行測定，用光譜法測量益母草提取液中的總堿量，從而探討不同溶劑、不同濃度和不同提取時間對益母草總堿提取率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，回流法結(jié)合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中溶劑A的平均生物堿提取率為0.217%，溶劑B的提取率為0.303%，溶劑C的提取率為0.317%。

浸漬提取法一般是在常溫下進(jìn)行，對熱敏性的物質(zhì)的提取很有利，但所需時間長，尤其是水作溶劑時易發(fā)霉變質(zhì)。在傳統(tǒng)的酸提法中加入95%的乙醇可增加其提取效率，縮短時間。本研究即對以酸及醇為溶劑的方法進(jìn)行了初步的探索。研究發(fā)現(xiàn)，浸漬法結(jié)合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中溶劑A的平均生物堿提取率為0.410%，溶劑B的提取率為0.340%。

大孔樹脂吸附技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新工藝，是將中草藥提取液通過大孔樹脂，吸附其中的有效成分，再經(jīng)洗脫回收，除掉雜質(zhì)的一種純化精制方法[3～5]。該技術(shù)目前已較廣泛應(yīng)用于中藥新藥的開發(fā)和中成藥的生產(chǎn)中，主要用于分離和提純過程。筆者選用了南開大學(xué)的藥用級ADS-A、ADS-B、ADS-C、ADS-D 4種樹脂進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)在提取液的pH值為6～8之間時，4種ADS大孔樹脂對生物堿均有吸附作用，其中pH值為8時ADS-B的靜態(tài)吸附最強(qiáng)。

[1]阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠，等.益母草的化學(xué)、藥理和臨床研究進(jìn)展[J].中草藥（增刊），2003，34（11）：15.

[2]張 穎，鞏學(xué)勇，冀海偉，等.翻白草中槲皮素的提取工藝優(yōu)化及含量測定[J].中國藥房，2008，19（30）：2345.

[3]史作清，施榮富，王春紅，等.樹脂吸附法在中草藥有效成分提取中的應(yīng)用[J].中草藥，2001，32（7）：660.

[4]何 琦，丁立生.大孔吸附樹脂銀杏黃酮提取純化性能研究[J].天然藥物研究與開發(fā)，2000，13（1）：56.

[5]馬振山.大孔樹脂吸附在藥學(xué)領(lǐng)域中的研究應(yīng)用[J].中成藥，1997，19（12）：40.