毛健，李榮亨

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶市 400016）

膿毒癥是由感染因素造成的全身性炎癥反應(yīng)，其危重患者常發(fā)生多器官功能障礙綜合征（MODS），腎臟是最常受累的器官之一。目前有學(xué)者認(rèn)同膿毒癥是包括微循環(huán)障礙的不可控的全身炎癥反應(yīng)[1]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是低氧應(yīng)答過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與能量代謝、血管生成、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激等相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，HIF-1α與缺血缺氧性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。筆者研究膿毒癥時(shí)應(yīng)用復(fù)原膠囊，觀察其對模型大鼠腎組織HIF-1α表達(dá)的影響，以探討其對腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

BX51T32E01型正立式顯微鏡（日本Olympus公司）；550型酶標(biāo)儀（美國Bio-med公司）；5810R型冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；22331型梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；UV-160IPC型紫外-分光光度計(jì)、AX200型精密電子天平（日本Kyoto公司）；RM2135型切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 試藥

復(fù)原膠囊（重慶希爾安藥業(yè)股份有限公司）；大鼠IL-6ELISA試劑盒、DEPC、PCR引物（上海Invitrogen公司）；SYBR Primer Ex Taq Kit（大連寶生物工程有限公司）；4%PFA、依紅、蘇木紫、PBS粉（北京中杉金橋公司）。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，♂，體質(zhì)量200～300 g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號：SYXK（渝）2007-0017）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制及分組、給藥

模型復(fù)制參照文獻(xiàn)[3]。大鼠麻醉、固定后，沿腹中線作一條長2 cm的切口，分離出盲腸，在回盲瓣下端以1號絲線結(jié)扎盲腸。用16號針頭在腸系膜對側(cè)盲腸表面上下兩端各穿孔1個(gè)形成盲腸漏，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。大鼠蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，以判斷模型的成功與否。術(shù)后大鼠予以自由攝食和飲水。假手術(shù)組只行腹腔關(guān)閉，不做結(jié)扎和穿孔。實(shí)驗(yàn)分為4組，即假手術(shù)、模型及復(fù)原膠囊高、低劑量（6.65、3.325 g·kg-1）組。每組分為3、6、12、24 h 4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)4只大鼠。ig給藥，1天1次，連續(xù)給藥4 d后復(fù)制模型。

2.2 RT-PCR檢測腎組織HIF-1α mRNA的表達(dá)

按Trizol試劑盒說明提取組織總RNA。HIF-1α：被擴(kuò)增的 cDNA引物長 200 bp，上游 5′-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3′，下游 5′-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3′；CyclophilinA作內(nèi)參：被擴(kuò)增的cDNA引物長192 bp，上游5′-GCATACAGGTCCTGGCATCT-3′，下 游 5′-TCTTGCTGGTCTTGCCATTC-3′。采用TAKAKA試劑盒一步法。PCR反應(yīng)條件為94 ℃5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃10 min，1個(gè)循環(huán)。瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝圖像，記錄光密度值。產(chǎn)物含量＝HIF-1α擴(kuò)增產(chǎn)物光密度值/CyclophilinA擴(kuò)增產(chǎn)物光密度值。

2.3 ELISA檢測血清IL-6水平

大鼠心臟取血0.5 μL，室溫放置后離心取血清，－20℃貯藏。參照大鼠血清IL-6 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 生化指標(biāo)檢測

大鼠心臟取血0.5 μL，室溫放置后離心取血清，檢測血清中尿素氮（BUN）指標(biāo)的變化。

2.5 HE染色病理學(xué)觀察

取腎組織用4%多聚甲醛固定，PBS浸泡過夜，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 復(fù)原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織HIF-α mRNA表達(dá)水平在各時(shí)相點(diǎn)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，復(fù)原膠囊高劑量組在3 h時(shí)相點(diǎn)HIF-1α mRNA表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05），其余各時(shí)相點(diǎn)均顯著降低（P＜0.01）；復(fù)原膠囊低劑量組24 h時(shí)相點(diǎn)HIF-1α mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。復(fù)原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達(dá)的影響見表1、圖1。

表1 復(fù)原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝4）Tab 1 Effect of Fuyuan capsule of mRNA expression of HIF-1α in kidney of model rats（±s，n＝4）

表1 復(fù)原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝4）Tab 1 Effect of Fuyuan capsule of mRNA expression of HIF-1α in kidney of model rats（±s，n＝4）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.sham group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組復(fù)原膠囊低劑量組復(fù)原膠囊高劑量組HIF-1α mRNA 24 h 0.49±0.032.40±0.20＊＊1.55±0.41#0.56±0.29##3 h 0.39±0.120.65±0.07＊0.78±0.280.92±0.07#6 h 0.45±0.071.23±0.12＊＊1.00±0.270.87±0.08##12 h 0.42±0.031.41±0.13＊＊1.25±0.100.73±0.13##

3.2 復(fù)原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-6含量隨時(shí)間逐漸增高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)原膠囊高劑量組各時(shí)相點(diǎn)IL-6含量均顯著降低（P＜0.05）。復(fù)原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響見表2。

圖1 復(fù)原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達(dá)的影響A.假手術(shù)組；B.模型組；C.復(fù)原膠囊低劑量組；D.復(fù)原膠囊高劑量組Fig 1 Effect of Fuyuan capsule of mRNA expression of HIF-1α in kidney of model ratsA.sham group；B.model group；C.Fuyuan capsule low dosage group；D.Fuyuan capsule high dosage group

表2 復(fù)原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響（±s，n＝4）Tab 2 Effect of Fuyuan capsule on the level of IL-6 in model rats（±s，n＝4）

表2 復(fù)原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響（±s，n＝4）Tab 2 Effect of Fuyuan capsule on the level of IL-6 in model rats（±s，n＝4）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組復(fù)原膠囊低劑量組復(fù)原膠囊高劑量組IL-6含量/pg·mL-1 24 h-1970.36±400.25＊1806.60±609.81587.91±410.08#3 h 204.69±60.52978.79±240.64＊1075.59±335.04#837.69±750.59#6 h-1133.23±160.44＊1118.79±217.26875.98±370.31#12 h-1315.13±340.51＊1226.25±668.35937.37±140.79#

3.3 復(fù)原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN含量在術(shù)后12、24 h時(shí)相點(diǎn)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)原膠囊高劑量組大鼠血清BUN含量在12、24 h時(shí)相點(diǎn)顯著降低（P＜0.05）。復(fù)原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響見表3

表3 復(fù)原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of Fuyuan capsule on the level of BUN in model rats（±s，n＝4）

表3 復(fù)原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of Fuyuan capsule on the level of BUN in model rats（±s，n＝4）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組復(fù)原膠囊低劑量組復(fù)原膠囊高劑量組BUN含量/mmol·L-1 24 h-9.33±1.01＊9.14±1.397.33±0.64#3 h 5.58±0.416.28±1.545.68±0.835.63±0.456 h-6.65±0.856.78±1.295.94±0.5112 h-8.66±1.07＊8.97±0.937.04±0.65#

3.4 腎組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)腎組織結(jié)構(gòu)清晰；模型組3 h時(shí)相點(diǎn)可見腎小球毛細(xì)血管輕度淤血、紅細(xì)胞滲出；6、12 h時(shí)相點(diǎn)可見出血、腎間質(zhì)腫脹明顯；24 h時(shí)相點(diǎn)腎小管區(qū)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞。復(fù)原膠囊高劑量組上述病理學(xué)變化較輕。大鼠腎組織病理學(xué)切片見圖2。

圖2 大鼠腎組織病理學(xué)切片（HE，400×100）A.假手術(shù)組；B.術(shù)后3 h模型組；C.術(shù)后3 h復(fù)原膠囊高劑量組；D.術(shù)后6 h模型組；E.術(shù)后6 h復(fù)原膠囊高劑量組；F.術(shù)后12 h模型組；G.術(shù)后12 h復(fù)原膠囊高劑量組；H.術(shù)后24 h模型組；I.術(shù)后24 h復(fù)原膠囊高劑量組Fig 2 Histopathological section of kidney in rat（sHE，400×100）A.sham group；B.model group after 3 h of post-operation；C.fuyuan capsule high dose group after 3 h of post-operation；D.model group after 6 h of post-operation；E.fuyuan capsule high dose group after 6 h of post-operation；F.model group after 12 h of post-operation；G.fuyuan capsule high dose group after 12 h of post-operation；H.model group after 24 h of post-operation；I.fuyuan capsule high dose group after 24 h of post-operation

4 討論

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后的常見并發(fā)癥之一。臨床上膿毒癥缺乏有效的治療措施，死亡率也居高不下，但有研究表明膿毒癥早期給予體液復(fù)蘇、增加組織氧氣運(yùn)輸，可使臨床預(yù)后明顯改善[4]。而以活血化瘀為基礎(chǔ)的中藥制劑血必凈是治療膿毒癥的有效藥物。因此，本研究模擬膿毒癥模型，并用中藥復(fù)原膠囊進(jìn)行治療，觀察其對機(jī)體的保護(hù)作用。

本研究表明，模型組大鼠可觀察到精神萎靡、嗜睡、活動(dòng)減少、呼吸急促、毛色晦暗、眼角存在分泌物等癥狀，腹腔內(nèi)滲出液體增加并可聞及惡臭，這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致，說明膿毒癥造模成功。模型組大鼠HIF-1α mRNA及炎癥介質(zhì)IL-6隨時(shí)間延長逐漸增高，二者變化趨于一致，且腎組織病理學(xué)損傷逐漸加重，提示IL-6的大量激活是導(dǎo)致臟器損傷的重要因素；復(fù)原膠囊高劑量組HIF-1α及炎癥介質(zhì)IL-6均降低，同時(shí)觀察到早期HIF-1α表達(dá)增高，但總體上腎組織學(xué)改變及腎功能損傷較輕。Cramer等[2]證實(shí)，HIF在調(diào)控髓細(xì)胞的能量代謝、聚集、遷移、侵襲及殺菌等方面起重要作用。因此，推測早期HIF-1 α mRNA的增高反映機(jī)體對病原體應(yīng)答強(qiáng)度的增高，激活大量吞噬細(xì)胞以消滅病原體。而敖啟林[5]通過HIF-1decoy抑制法發(fā)現(xiàn)HIF-1α促進(jìn)炎癥介質(zhì)TNF-α的表達(dá)，并提示存在一個(gè)“炎癥-炎癥介質(zhì)-HIF-炎癥介質(zhì)-炎癥”的正反饋環(huán)。本實(shí)驗(yàn)中筆者也證實(shí)；HIF-1α mRNA總體水平表達(dá)的降低使炎癥介質(zhì)IL-6表達(dá)水平降低，對發(fā)生膿毒癥時(shí)的腎組織起保護(hù)作用。

復(fù)原膠囊由黃芪、曬參、當(dāng)歸、川芎、丹參、三七等組成，具有益氣活血的功效。臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，活血化瘀法不僅可調(diào)節(jié)凝血/抗凝失衡，抑制有害血管活性介質(zhì)的釋放，還阻斷病因及不同病機(jī)的凝血功能紊亂觸發(fā)因素，在凝血功能紊亂不同階段發(fā)揮有益作用。黃芪具有補(bǔ)氣固表、脫毒排膿、斂瘡生肌之功，研究表明黃芪提取物可有效抑制LPS引發(fā)的人類羊膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、前列環(huán)素（PGE2）及白細(xì)胞三烯4（LTC4），具有較好的抗炎作用；此外還有清除自由基、抑制P-選擇素表達(dá)的作用[6]。三七的有效成分除能夠減少白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附及過氧化物的產(chǎn)生外，還可以減少肥大細(xì)胞脫顆粒及降低促炎因子IL-6和TNF-α的水平。黃芪、川芎、丹參、三七等藥能清除氧自由基，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低毛細(xì)血管通透性，改善缺血/再灌注損傷，調(diào)節(jié)免疫，抑制血小板活化、聚集及血栓形成等[7]。

綜上所述，復(fù)原膠囊通過對HIF-1α表達(dá)的調(diào)控減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎功能，可能與其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)免疫抑制全身炎癥反應(yīng)，并改善微循環(huán)有關(guān)。

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[5]敖啟林.脂多糖活化的大鼠巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生新機(jī)制[J].中國病理生理雜志，2006，22（1）：148.

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