班立麗，張慧，羅敏，楊兵兵，韓宏升，潘敏，李瑪琳#

（1.昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥劑科，昆明市 650101；2.昆明醫(yī)學院省天然藥物藥理重點實驗室，昆明市 650031）

血管生成是指從已存在的微血管上長出新毛細血管的過程。研究表明，血管生成在腫瘤的轉移、彌散發(fā)展過程中發(fā)揮著決定性的重要作用[1]?？鼓[瘤血管生成已成為近年來抗腫瘤藥研究的新策略。毛萼乙素（ER-B）是從毛萼香茶菜屬分離鑒定出來的一種二萜類化合物，已證實具有抑制多種腫瘤細胞株的增殖[2]和抑制正常血管生成的作用。本研究應用人肝癌細胞誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型以及原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），探討毛萼乙素對腫瘤誘導的血管生成以及對HUVEC增殖的影響，以進一步證實毛萼乙素對血管生成的抑制作用，為將其開發(fā)成抗腫瘤藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；SW-CJ-IF型凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海滬南科學儀器聯(lián)營廠）；HP-SCANJET4570C型掃描儀（美國惠普公司）。

1.2 試藥

毛萼乙素（由中國科學院昆明植物所孫漢董院士提供）；反應停（江蘇常州制藥廠，批號：0501311）；滅菌超級無支原體新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所，批號：040603）；胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：AJC9872）；內皮細胞生長因子（美國Upstate公司，批號：02-102）；MTT（美國Sigma公司，批號：1672B45）。

1.3 動物及細胞株

雞胚，德國海蘭雞種，購自昆明實驗養(yǎng)雞場（動物許可證號：2004C）。

細胞株：HUVEC（原代培養(yǎng)獲得，經(jīng)免疫組化抗-TM標記FITC法鑒定證實）；人肝癌SMMC-7721細胞株（購自中國科學院上海生命研究所細胞庫）。

2 方法

2.1 試劑的制備

2.1.1 毛萼乙素溶液的制備：稱取適量毛萼乙素，用100%的DMSO溶液制備成10 mg·mL-1的溶液（母液），再用無菌生理鹽水倍比稀釋，用于體外內皮細胞增殖實驗；另配制20、10、5μg·mL-1的溶液，用于毛萼乙素作用下的HUVEC生長曲線的測定；另配制10、5、2.5 mg·mL-1的溶液，用于雞胚尿囊膜實驗。

2.1.2 反應停溶液的制備：用無菌的DMSO溶液將適量的反應停配制成12.5 mg·mL-1的貯備液。應用時用RPMI-1640液稀釋至所需濃度。

2.2 HUVEC的原代、傳代培養(yǎng)及鑒定

HUVEC的原代培養(yǎng)按照Beecken等[3]報告的方法進行。傳代培養(yǎng)按常規(guī)方法進行，傳至3代時備用。最后進行血管內皮細胞鑒定[4]：（1）倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特點；（2）免疫組化FITC法鑒定內皮細胞。

2.3 毛萼乙素對HUVEC增殖的影響

采用改良MTT法：取對數(shù)生長期HUVEC，消化后以每孔4×104個細胞接種于96孔板，每孔90 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的毛萼乙素，使其終濃度達30、10、3、1、0.3、0.1μg·mL-1。分別設30%、10%、3%、1%、0.3%、0.1%毛萼乙素組，DMSO溶劑對照組和0.9%生理鹽水陰性對照組。連續(xù)培養(yǎng)2 d后加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入三聯(lián)液后12～16 h內以自動酶標儀測量570 nm波長處吸光度（OD）值，計算細胞生長抑制率。抑制率計算公式如下：細胞存活率（%）＝加藥孔的實際OD值/陰性對照孔的OD值；細胞抑制率（%）＝100%－細胞存活率。用GWBA-SIC軟件計算其IC50值及95%可信區(qū)間。

2.4 毛萼乙素對HUVEC生長的影響

采用文獻[5]方法并適當改進。取對數(shù)生長期HUVEC，消化后以每孔1×104個細胞濃度接種，其中含20%胎牛血清在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于第1、2、3、4、5、6天各取3孔細胞，用改良MTT法測量570 nm波長處OD，以平均值繪制生長曲線，觀察HUVEC生長的情況。

2.5 毛萼乙素對雞胚尿囊膜（CAM）人肝癌血管生成的影響

首先復制CAM人肝癌血管生成模型[6]。實驗分為5組，即陰性對照、反應停（50μg·egg-1）及毛萼乙素高、中、低劑量（100、50、25 μg·egg-1）組。選擇已接種肝癌細胞的成瘤雞胚，在成瘤處放置明膠海綿，按組各加10μL試液于明膠海綿上，孵育到第5天。取出雞胚，觀察各組存活雞胚移植瘤生長的情況，以腫瘤直徑2 mm為成瘤陽性，分別記錄結果。然后以丙酮固定CAM，剪下平鋪于平皿中，用掃描儀掃描，Imagetool軟件處理圖像，計算所選區(qū)域血管面積、血管數(shù)目。按下式計算血管生成抑制率：抑制率（%）＝（對照組血管定量的數(shù)值－受試組血管定量的數(shù)值）/對照組血管定量的數(shù)值×100%。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 HUVEC的原代培養(yǎng)、傳代及鑒定

3.1.1 HUVEC的原代培養(yǎng)與傳代：HUVEC接種后，大部分細胞呈貼壁生長。早期細胞較小，呈多角形、紡錘狀。48～72 h后生長加快，逐漸生長成梭形，呈魚貫狀相連，間有漩渦狀排列。7～10 d后細胞長滿，相互嵌合為單層鋪路石狀。傳代培養(yǎng)后細胞4 h內貼壁生長，生長迅速。HUVEC在光鏡下的形態(tài)見圖1。

3.1.2 HUVEC的鑒定：采用免疫組化FITC法對HUVEC進行鑒定。未經(jīng)抗體標記的陰性對照中，偶見細胞上綠色斑點散發(fā)的熒光，細胞輪廓不完整。經(jīng)抗TM免疫熒光標記的內皮細胞胞漿中有黃綠色的熒光，熒光染色強陽性，胞核呈藍色，細胞輪廓較完整。HUVEC經(jīng)FITC標記后在熒光顯微鏡下的形態(tài)見圖2。

圖2 HUVEC經(jīng)FITC標記后在熒光顯微鏡下的形態(tài)（×400）A.陰性對照組；B.經(jīng)FITC標記后的HUVECFig 2 Morphology of HUVEC stained by FITC under fluorescence microscope（×400）A.negative control group；B.HUVEC stained by FITC

3.2 毛萼乙素對HUVEC增殖的影響

用MTT試驗檢測6個濃度毛萼乙素對HUVEC增殖的影響，結果見表1。

表1 毛萼乙素對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響Tab 1 Effect of eriocalyxin B on the proliferation of HUVEC

從表1中可看出，毛萼乙素對HUVEC增殖有明顯的抑制作用，IC50＝7.27 μg·mL-1，在所測試的范圍內呈現(xiàn)出量效依賴關系。

3.3 毛萼乙素對HUVEC生長影響的時效關系

毛萼乙素對第3代HUVEC作用0、24、48、72、96、120 h，觀察HUVEC的增殖情況。5μg·mL-1的毛萼乙素要作用4 d后才對HUVEC生長有抑制作用（P＜0.05），抑制率為30.3%。隨著濃度的提高，毛萼乙素起效的時間提前。毛萼乙素20μg·mL-1時，在作用24 h后抑制率達45.9%（P＜0.05）；在10 μg·mL-1時，作用24 h后抑制率達25%，48 h后達43.9%（P＜0.05）。

3.4 毛萼乙素對人肝癌移植瘤誘導的CAM血管生成的影響

在人肝癌CAM血管生成模型上，觀察不同濃度毛萼乙素對人肝癌移植瘤誘導的腫瘤血管生成的影響。結果，明膠海綿陰性對照組周圍血管良好，呈樹枝狀分布，分枝適中；加有毛萼乙素100μg·egg-1的明膠海綿周圍血管數(shù)目顯著少于陰性對照組，且血管變細，血管形態(tài)異常，尤其是小血管數(shù)目顯著減少，而且腫瘤組織周圍可見部分白色無血管區(qū)。經(jīng)劑量分別為100、50、25 μg·egg-1的毛萼乙素處理后，CAM人肝癌移植瘤誘導的血管生成受到了不同程度的抑制，抑制效應呈劑量依賴性（r＝－0.945，P＜0.01）；陽性對照反應停在50 μg·egg-1時對肝癌細胞誘導的血管生成也有顯著的抑制作用（P＜0.05），抑制率為41.41%；在低劑量時，毛萼乙素對血管生成的抑制作用低于反應停（P＜0.05）；劑量在100 μg·egg-1時，毛萼乙素對血管生成的抑制作用優(yōu)于反應停（P＜0.05）。不同濃度毛萼乙素對人肝癌移植瘤誘導的CAM血管生成的影響見表2。

表2 不同濃度毛萼乙素對人肝癌移植瘤誘導的CAM血管生成的影響Tab 2 Inhibitory effect of eriocalyxin B at different concentrations on chicken chorioallantoic membrane angiogenesis induced by human hepatocellular carcinoma

4 討論

有研究表明[7]，在腫瘤組織中，一個血管內皮細胞可支持50～100個腫瘤細胞的生長，并且腫瘤細胞的數(shù)目與內皮細胞的數(shù)目密切相關。因此，在篩選有效的腫瘤血管生成抑制劑時，監(jiān)測藥物對內皮細胞增殖的作用尤為重要。目前，抑制新生血管生長的大多數(shù)藥物主要以血管內皮細胞為靶點。

內皮細胞的選擇對篩選血管生成抑制劑也是十分重要的。相對而言，直接從臍帶中分離、培養(yǎng)HUVEC來源充足、取材及操作方便，研究結果更真實地反映人正常血管生成的情況，因而許多學者都選擇原代培養(yǎng)的HUVEC來研究血管生成。本研究以第3代HUVEC為對象，觀察毛萼乙素對HUVEC增殖的影響。研究中觀察到毛萼乙素在0.1～30 μg·mL-1范圍內，對HUVEC增殖的抑制作用隨劑量的增加逐步增強，呈現(xiàn)良好的量效關系和時效關系。有報道雷公藤甲素在0.05 μg·mL-1時就明顯抑制HUVEC的增殖，是HUVEC增殖的強抑制劑[5]魚軟骨多糖在62.93 mg·mL-1時對HUVEC的增殖有抑制作用[8]；本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Endostatin的一個有效片段Kringle5在11.85 μg·mL-1時明顯抑制內皮細胞的增殖，抑制率達50%。比較而言，毛萼乙素的抑制強度大致為中等水平。

CAM是血管生成的經(jīng)典實驗模型之一，由于具有方法簡便、易觀察、價廉等優(yōu)點，是目前常用的在體模型。該模型能較好的模擬體內腫瘤誘導的血管生成過程，用于篩選血管生成抑制劑時能更真實地反映藥物對腫瘤血管生成的抑制作用。

本研究分別選取體內、體外2種典型的血管生成實驗方法，探討了毛萼乙素對血管生成的影響。結果證實，毛萼乙素在體外可抑制HUVEC的增殖，在體內可抑制人肝癌雞胚移植瘤誘導的血管生成，其作用機制可能是通過抑制血管內皮細胞的增殖影響腫瘤血管的生長。然而，毛萼乙素除了直接通過抑制內皮細胞的生長來抑制腫瘤誘導的血管生成以外，是否可能還通過其他途徑發(fā)揮其抑制血管生成的作用？其次，毛萼乙素在抑制血管生成的過程中是否會影響正常組織？這些問題將是今后研究的方向。

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