謝 露，王麗萍，陳蒙華，黎 靜

(1.廣西醫(yī)科大學生理學教研室，2.廣西醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管病研究所，南寧 530021)

血管內皮細胞是血液與血管組織間的一道半通透屏障，具有非常重要的保護和分泌調節(jié)功能，如維持血管內皮依賴性舒張活性，調節(jié)血管的收縮和舒張，維持凝血和抗血栓功能的平衡，使血管內膜表面無血栓形成。內皮細胞受損會引起上述生理作用減弱或喪失，因此，保護內皮細胞免受損害或逆轉或改善內皮細胞功能障礙在血栓性疾病的防治中具有重要意義。我們通過實驗研究發(fā)現，海帶多糖(PL)L01對大劑量腎上腺素引起的大鼠血管內皮細胞損傷有保護作用，從而保護其抗血栓功能【1】。本研究通過觀察腎上腺素對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical venousendothelial cell，HUVEC)超微結構的損害及海帶多糖的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞株購于上海午立公司，由本研究室自行傳代。腎上腺素注射液(廣州明興制藥廠)。DMEM培養(yǎng)基干粉(Gibco公司)。小牛血清(杭州四季清生物工程公司)。胰蛋白酶(DIFCO公司)。3111CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)。1450超凈工作臺(蘇州市黃浦空調凈化設備有限公司)。XSB-1A倒置顯微鏡(梧州光學儀器廠)。BD-211電子天平(SATORIOUS，德國)。日立H500型投射電鏡(日本)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 海帶多糖制劑 海帶干粉，加水調漿，先經纖維素酶和中性蛋白酶水解，后經鹽酸浸泡、乙醇沉淀得海帶多糖粗品。粗品經DEAE-纖維素柱分離得到含量最高的組分。

1.2.2 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)和分組 取HUVEC細胞株(4～10)×104cells/ml接種于D MEM培養(yǎng)基(含 10%小牛血清，青、鏈霉素各100U/ml)中，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換半液，生長至融合狀態(tài)，倒置顯微鏡下觀察細胞呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，取對數生長期用于實驗。將HUVEC用0.25%胰蛋白酶消化，以5×104cells/cm2密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后換液，分組:正常組(不加藥物)、Adr組(10μg/ml Adr)、PL 組(0.1 mg/ml PL)、低劑量PL(L-PL)+Adr組(0.01 mg/ml PL+10μg/ml Adr)，高劑量 PL(H-PL)+Adr組(0.1 mg/ml PL+10μg/ml Adr)。每組8孔。

1.2.3 電鏡標本的制備 HUVEC接種后24h棄去培養(yǎng)液，用低濃度胰酶消化，移入離心管，1000～1500r/min離心5～10min，吸棄上清液，加入胎牛血清 1滴，然后吹散離心物使其混合，再離心3～5 min，吸棄上清。用 2%戊二醛固定后，再用鋨酸固定。梯度乙醇脫水，Epon 812樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙染色，日立H500透射電鏡下觀察。

2 結果

2.1 電鏡下各組HUVEC細胞核形態(tài)

正常組細胞核類圓形，核膜完整，核仁圓潤、清晰。Adr組細胞核形態(tài)不規(guī)則，核表面呈現多處突出或向內凹陷，核仁固縮、邊界模糊。PL組和H-PL+Adr組細胞核形態(tài)與正常組比較無明顯改變。L-PL+Adr組細胞核形態(tài)不規(guī)則，表面有凹陷，核仁固縮，但邊界清晰(圖1)。

2.2 電鏡下各組HUVEC線粒體形態(tài)

正常組線粒體結構完好，嵴清晰可見。Adr組線粒體腫脹，嵴消失，空泡化。PL組和H-PL+Adr組線粒體形態(tài)與正常組比較無明顯改變。L-PL+Adr組線粒體無腫脹，嵴依稀可見，內有空泡(圖2)。

Fig.1 Electron micrograph of HUVEC in five groups showing nuclear contour(×2.8 k)

Fig.2 Electron micrograph of HUVEC in five groups showing mitochondria contour(×3 k)

3 討論

我們實驗研究發(fā)現，Adr與HUVEC共培養(yǎng)后，對細胞核和線粒體的損害明顯，這與其代謝產物的毒性作用有關。Adr可在A型單胺氧化酶作用下，脫氨生成甲胺，后者在氨基脲敏感胺氧化酶作用下生成甲醛、過氧化氫和氨，這三種產物具有很強的細胞毒性【2，3】。細胞核和線粒體損傷將使內皮細胞能量代謝、活性物質表達發(fā)生嚴重障礙，失去其原有的生理功能。實驗中單獨加入PL，對HUVEC超微結構無明顯影響，加入PL+Adr后，HUVEC超微結構改變情況與PL劑量相關，L-PL+Adr組的細胞核形態(tài)明顯變形，線粒體內有空泡，而H-PL+Adr組細胞核和線粒體結構都完好，說明 PL能夠拮抗Adr和(或)脫氨產物對HUVEC細胞核、線粒體超微結構的損害。

我們在前一階段的研究中發(fā)現海帶多糖能夠拮抗注射Adr引起的大鼠內皮損傷，形態(tài)學觀察可見，給藥組內皮細胞脫落、損失較輕，完整內皮長度明顯大于模型組【1】。在本研究中，我們深入觀察Adr對HUVEC的超微結構的損害及海帶多糖的保護作用，結果進一步說明了海帶多糖能夠保護血管內皮細胞的結構完整性，因此可維護其調節(jié)血管張力、止血與抗凝血平衡等正常生理功能。海帶多糖是否能夠減少Adr代謝產物生成或是能夠阻止代謝產物進入細胞產生毒性作用?其作用機理還有待于探討。

[1]謝 露，劉愛群，黎 靜，等.海帶多糖對腎上腺素致血管內皮細胞損傷的保護作用[J].中國應用生理學雜志，2007，23(2):143-146.

[2]Boor P，Trent M B，Lyles G A，et al.Methylamine metabolism to formaldehyde by vascular semicarbazide-sensitive amine oxidase[J].Toxicol，1992，73(3):251-258.

[3]Yu P H，Lai C T，Zuo D M.Formation of formaldehyde from adrenaline invivo;a potential risk factor for stress-related angiopathy[J].Neurochem Res，1997，22(5):615-620.