穆建琴 ，魏路清

(1.武警醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300162;2.新疆阿克蘇武警兵團指揮部，阿克蘇 843000)

肺纖維化是以肺間質炎性細胞浸潤、成纖維細胞增生和膠原蛋白沉積為特征的慢性炎癥性疾病。發(fā)病機制尚不十分清楚，臨床上缺乏有效的治療手段。因此，探索新的治療方法或治療途徑是目前亟待解決的問題。目前肺纖維化的研究已經趨向于多因子，多因素的綜合研究。研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化的起始階段表現(xiàn)為肺泡炎，此時大量炎性細胞向肺內浸潤、活化，釋放多種細胞因子，形成瀑布效應，激活多種細胞，誘導肺成纖維細胞活化、增殖和分泌胞外基質，最終形成肺纖維化。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種重要的多肽生長因子，也是FGF家族中原型成員之一。隨著對細胞因子在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中作用認識的逐漸深入，有研究[1]發(fā)現(xiàn)bFGF在纖維化的肺組織、血清、肺泡灌洗液中有高表達并呈正相關，這提示bFGF表達增強與肺纖維化關系密切，本研究采用博萊霉素氣管內注入，復制肺纖維化動物模型，抗bFGF抗體進行干預，通過HE染色觀察肺泡炎和Masson染色觀察肺纖維化 ，檢測肺組織、血清及肺泡灌洗液(BALF)中bFGF的變化，探索抗纖維化作用的機制與抗bFGF抗體中和bFGF抑制其表達的關系。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

Wistar大鼠購自軍事醫(yī)學科學院動物所。鹽酸氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司)，0.1 g。博萊霉素(A5，批號051003，天津太河制藥有限公司生產)，8 mg?？筨FGF抗體(購于北京賽馳生物公司)，0.5 ml(效價1∶12500)。bFGF定量酶免疫測定(ELISA)試劑盒，購于河北博海生物公司。

1.2 動物模型的建立[2]和實驗分組

選擇雌性Wistar大鼠30只，體重180～250g，按照隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為3組(n=10):(1)對照組(C組);(2)模型組(M組);(3)抗bFGF抗體組(K組)。以鹽酸氯胺酮(100mg/kg，0.1 g)腹腔內注射麻醉大鼠后，經頸正中切口，M組、K組給大鼠氣管內注入博萊霉素復制肺纖維化模型，C組氣管內注入同等劑量的生理鹽水作對照，K組于造模后1，2，3，8，12，19，25 d 腹腔內注射抗 bFGF 抗體 。上述各組均于注藥后第1周、第4周各宰殺5只。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本的采集 大鼠麻醉后稱體重、開腹，用鹽水紗布鈍性分離暴露腹主動脈，采集動脈血分別行血氣分析檢查及留取血清標本，離心后于-70℃凍存，待測bFGF。處死動物后開胸，于頸部切斷主氣管，向下剝離，取出全肺稱重，以便計算肺系數(shù)，計算公式為肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g)×100%。結扎左肺門，切除左全肺，于-70℃凍存留作其他檢查。經氣管置人12號鈍性針頭，結扎后以無菌生理鹽水灌洗右肺，每次5 ml，灌洗 3次，回收灌洗液，BALF離心后上清液分裝于無菌離心管中，置于-70℃凍存，待測bFGF。經氣管向右肺注入10%的中性福爾馬林4～6 ml使胸膜展開，結扎氣管，再置于10%福爾馬林中固定，制備石蠟切片供組織學檢查。

1.3.2 肺泡炎、肺纖維化程度 觀察方法參照文獻的嚴重程度分級方法進行累積評分，統(tǒng)計學處理后加以比較。具體步驟如下:(1)進行HE染色，參照Szapiel[3]等方法，觀察肺泡炎程度。(2)參照Fulmer[4]方法 ，利用Masson氏三色染色的切片觀察肺纖維化的情況。

1.3.3 免疫組化法檢測肺組織bFGF表達 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，然后按ELISA試劑盒說明書進行操作。應用圖像分析，每張片子取5個視野，bFGF陽性表達產物為棕黃色細顆粒狀，分別測定其在本視野的面積百分比的均值，作為該大鼠的測定值。

1.3.4 ELISA測定血清和肺泡灌洗液的bFGF含量將離心后的血清和肺泡灌洗液的上清液置于-70℃凍存，依照bFGF ELISA試劑盒說明書的步驟操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 肺系數(shù)變化

1、4周時M組肺系數(shù)高于C組(P＜0.05)，K組低于M組(P＜0.05)。

2.2 肺組織病理學改變

C組肺組織結構正常(圖1A，2F)。1周時M 組表現(xiàn)為肺泡炎及肺間質炎癥(圖1B，2G)，K組肺泡炎較M組減輕(圖1C，2H);4周時M組肺泡結構破壞，間質纖維組織增生，形成廣泛性纖維化，但仍有肺泡炎存在(圖1D，2I)，K組肺組織結構部分破壞，肺泡腔有少量炎細胞滲出，肺泡間隔輕度增厚，間質纖維組織增生不明顯，無明顯纖維化改變(圖1E，2J，圖1，2見下頁)。其累積評分見表1。

Tab.1 Changes of lung coefficients，histopathology and arterial oxygen tension(，n=5)

Tab.1 Changes of lung coefficients，histopathology and arterial oxygen tension(，n=5)

C:Control group;M:Model group;K:Anti-bFGF group;1 mmHg=0.1333 kPa*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs M group

Group First week Lung coefficients Alveolar catarrh degree(score) PaO2(mmHg)Fourth week Lung coefficients Pulmonary fibrosis degree(score) PaO2(mmHg)C 9.6±1.7 1.2±0.4 96.8±13.8 9.7±1.5 1.0±0.0 97.0±10.3 M 13.3±1.7* 3.6±0.5** 61.5±20.7* 14.2±1.8* 4.2±0.8** 57.5±13.6*K 12.3±2.7* 2.8±0.9* 64.3±13.7* 11.8±1.7* 2.7±0.8** 76.8±12.6

2.3 各組大鼠PaO2變化

1周時M組低于C組(P＜0.05)，K組與M組差異無顯著性(P＞0.05)，4周時M組PaO2低于C組(P＜0.05)，K組的PaO2高于M組(P ＜0.05，表1)。

2.4 各組大鼠肺組織免疫組化bFGF的變化

1周時M組(圖3L)的bFGF表達高于C組(圖3K，P＜0.01)，K組(圖3M)的bFGF表達低于M組(P＜0.01);4周時M 組(圖3N)的bFGF表達高于C組(P＜0.01)，K組(圖3O)的bFGF表達低于M 組(P＜0.01，表2)。

Tab.2 bFGF concentration changes in lung，serum and BALF of the rats(，n=5)

Tab.2 bFGF concentration changes in lung，serum and BALF of the rats(，n=5)

C:Control group;M:Model group;K:Anti-bFGF group*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs M group

Group Lung First week Fourthweek Serum First week Fourth week BALF First week Fourth week C 0.167±0.031 0.155±0.016 0.182±0.014 0.170±0.115 0.711±0.039 0.711±0.039 M 0.276±0.017** 0.294±0.027** 0.457±0.034** 0.368±0.032 0.655±0.039 0.799±0.013**K 0.203±0.051## 0.205±0.052## 0.265±0.167# 0.174±0.012## 0.204±0.030## 0.169±0.031##

2.5 各組大鼠血清及肺泡灌洗液bFGF的變化

血清中bFGF的表達:1周時M組的表達高于C組(P＜0.01)，K組表達低于M 組(P＜0.05);4周時M組的表達高于C組(P＜0.01)，K組表達低于M組(P＜0.01)。肺泡灌洗液(BALF)中bFGF的表達:1周時M組的表達與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，K組表達低于M組(P＜0.01);4周時M組的bFGF表達高于C組(P＜0.01)，K組表達低于M 組(P＜0.01，表2)。

Fig.1 Light micrographs of rat lung on 1，4 week in each group(HE ×100)

Fig.2 Light micrographs of rat lung on 1，4 week in each group(Masson ×100)

Fig.3 Light micrographs of rat lung on 1，4 week in each group(immunohistochemistry ×100)

3 討論

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是指原因不明并以炎性細胞的聚集、膠原蛋白的過度沉積及成纖維細胞的異常增殖和分化為主要特征的一種慢性炎癥性間質性肺疾病。本實驗采用博萊霉素氣管內注入復制肺纖維化動物模型，選擇模型的肺泡炎高峰期(1周)、肺纖維化形成穩(wěn)定期(4周)作為觀察點，通過腹腔注射抗bFGF抗體進行干預。結果發(fā)現(xiàn)，1、4周時M組肺系數(shù)高于C組(P＜0.05)，K組低于M 組(P＜0.05)。肺系數(shù)的改變顯示抗bFGF抗體干預后肺纖維化程度減輕;各組大鼠PaO2變化:1周時M 組低于C組(P＜0.05)，K組與M組差異無顯著性(P＞0.05)，4周時M組PaO2低于C組(P＜0.05)，K組的PaO2高于M組(P＜0.05)。血氣分析檢查亦顯示K組PaO2比M組改善;M組1周病理改變肺泡炎及肺間質炎癥，4周時M組肺泡結構破壞，間質纖維組織增生，形成廣泛性纖維化，但仍有肺泡炎存在;K組1周時肺泡結構存在，肺泡間隔增生程度輕，肺泡炎范圍小，膠原纖維增生程度輕。K組4周肺組織結構部分破壞，肺泡腔有少量炎細胞滲出，肺泡間隔輕度增厚，間質纖維組織增生不明顯，無明顯纖維化改變。本實驗從M組病理結果可以看出，博萊霉素氣管內注入復制肺纖維化動物模型是成功的，此模型作為目前國際上IPF研究的動物模型，依據(jù)是病理改變符合藥物性肺纖維化。以上結果表明抗bFGF抗體干預后，K組大鼠的肺纖維化程度明顯較M組減輕，故可以證明抗bFGF抗體干預后可減輕博萊霉素誘導的肺纖維化。

細胞因子中和抗體有著廣闊應用前景，不但可以單純阻斷單個細胞因子的作用，而且由于其相互作用網(wǎng)絡的存在，這些抗體的使用必然會為揭示網(wǎng)絡結點之間的數(shù)理關系提供有用的線索。已在實驗中得到證實[5，6]抗纖維化細胞因子IFNγ可明顯減輕博萊霉素或二氧化硅誘發(fā)的肺纖維化。國外[7]最近發(fā)現(xiàn)肺纖維化時，內皮素的表達增加，內皮素受體拮抗劑可減輕博萊霉素誘發(fā)的肺纖維化。本研究就是基于上述理論依據(jù)，采用腹腔注射抗bFGF抗體進行干預，通過檢測肺組織、血清及BALF中bFGF的變化，探索肺纖維的發(fā)病機制。結果提示，從免疫組化圖片可以看出，bFGF主要表達于大氣道壁和血管壁的平滑肌細胞，正常組僅在氣管平滑肌少量表達;M組1周時bFGF免疫組化呈陽性反應，K組的bFGF表達較M組減少;M組4周時bFGF免疫組化呈強陽性反應，K組的bFGF表達與同期的M組相比，免疫組化反應有較明顯的減弱。K組1，4周經過bFGF抗體與抗原結合后，肺纖維化程度明顯較M組減輕。從上述結果中可以看出，肺纖維化的程度與bFGF表達呈正相關。此結果與文獻[8]報道一致。1周時K組的血清及BALE中bFGF的表達與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義，4周時差異有統(tǒng)計學意義。說明1周時為肺泡炎癥期，bFGF的表達不高，Osaki等[1]發(fā)現(xiàn)bFGF and TGF-β通過分別誘導成纖維細胞增殖和分化而在肺纖維的不同階段分別起關鍵性的作用，常發(fā)現(xiàn)bFGF在肺纖維化期(4周)高表達并起促纖維化作用，方向群[9]等發(fā)現(xiàn)bFGF在肺纖維化模型的14天后水平開始升高。結合本實驗結果，4周時K組的肺組織、血清及BALE中bFGF的表達與C組比較，差異有統(tǒng)計學意義，與文獻[9]報道一致。

近年來，隨著bFGF及其抗體研究的深入，發(fā)現(xiàn)通過抑制bFGF生物活性從而抑制某些組織病變，阻斷疾病的發(fā)生發(fā)展。bFGF由于可以促進成纖維細胞的增生和膠原纖維的合成而被認為是一個與肺纖維化有關的細胞因子。在肺纖維化的發(fā)展中，成纖維細胞增殖和膠原纖維的形成是病變發(fā)生發(fā)展的關鍵，而成纖維細胞的調控受巨噬細胞分泌的bFGF的影響，兩者關系密切。Rcily等[10]研究證明，抗bFGF抗體中和bFGF，抑制bFGF與成纖維細胞表面的受體結合，從而抑制其發(fā)揮生物學效應。bFGF的分泌方式是自分泌或旁分泌，通過細胞損傷或死亡釋放出來而起作用。bFGF的受體廣泛分布于膠質細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞等多種細胞中。bFGF與其受體結合，能產生廣泛的細胞效應，促進細胞增生分化和血管生成，阻止細胞凋亡，刺激和調節(jié)血管內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞和神經膠質細胞等多種細胞分化增殖。成纖維細胞生長因子通過作用細胞表面酪氨酸激酶受體發(fā)揮它們的生物活性。本實驗的結果再次可以證實，bFGF在肺纖維化期起作用并與肺纖維化程度呈正相關，應用抗bFGF抗體中和bFGF，把病變控制在肺泡炎階段，抑制bFGF與成纖維細胞表面的受體結合，從而阻止了成纖維細胞增殖與纖維化的發(fā)展。這為臨床肺纖維的發(fā)病機理提供了理論依據(jù)，為肺纖維化的治療提供了一個新的方法。

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