陳 悅，徐 曉，魯 穎

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，開封 475004)

葛根系豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根素(puerarin，Pur)是從其干燥根中分離出來(lái)的單體，化學(xué)名為4，7-二羥基 8-β-D 葡萄糖異黃酮(4H-1-Benzopyran-4-one，8-B-D-glucopyranosyl-7-hydroxy 3-4-hydroxyphenyl)。由于其化學(xué)成分具有獨(dú)特的生物活性，備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。Pur對(duì)心血管系統(tǒng)的作用已經(jīng)得到證實(shí)[1]，但Pur究竟是通過(guò)何種途徑發(fā)揮作用，具體機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)用常規(guī)微電極方法和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察并記錄葛根素對(duì)大鼠心室肌動(dòng)作電位和心室肌細(xì)胞鉀離子流的影響，以探討Pur抗心律失常的電生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

體重200～230g大鼠，雌雄不限，鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。臺(tái)氏液成分(mmol/L):NaCl 143.0，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl20.5，NaHCO323.8，NaH2PO40.3，glucose 10，95%O2和5%CO2飽和，pH 7.3。無(wú)鈣臺(tái)氏液(mmol/L):NaCl 100，KCl 10，MgSO45.0，glucose 20，taurine 10，MOPS 10，用KOH將pH調(diào)至7.3。葛根素注射液，安徽同仁藥業(yè)有限公司出品，批號(hào)H20045081。膠原酶Ⅱ，Taurine，MOPS，HEPES，Tris-GTP，EGTA，均購(gòu)自Sigma公司。TTX，大連瑞芳生物物品有限公司。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄 將大鼠擊昏后，速取心臟置于37℃95%O2和5%CO2飽和臺(tái)氏液中，分離出心室肌用0號(hào)不銹鋼針固定于恒溫(36±0.5)℃、恒流(5 ml/min)灌流槽底部。以直徑0.5 mm不銹鋼電極作細(xì)胞外刺激。用微操縱儀將電極插入心室肌細(xì)胞，待放大器上顯出電位-70～-90mV即為靜息電位，然后用刺激器經(jīng)刺激隔離器輸出波寬5 ms、頻率1 Hz、強(qiáng)度為閾值的1.5倍的刺激。記錄電極為充3mmol/L KCl的玻璃電極，電阻為10～15 MΩ，插入到細(xì)胞內(nèi)引出動(dòng)作電位，信號(hào)經(jīng)微電極放大器放大后輸入雙線示波器中，同時(shí)經(jīng)BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī)中，用MCP2000程序顯示、處理分析。

1.2.2 大鼠心室肌細(xì)胞分離 將大鼠擊昏后，速取心臟置于4℃MOPS液中(3-(N-嗎啉基)丙磺酸緩沖液，MOPS BUFFER)，去除周圍結(jié)締組織。將心臟連于Langendorff灌流裝置上，經(jīng)主動(dòng)脈逆向灌流。先用無(wú)鈣MOPS液灌流5 min，然后用含50μmol/L Ca2+和0.035%膠原酶Ⅱ、1% 牛血清白蛋白的MOPS液灌流5 min取下心臟，剪去心房，在含有100μmol/L Ca2+和1% 牛血清白蛋白的MOPS液中剪碎、吹打、溫孵10min，尼龍網(wǎng)過(guò)濾，將細(xì)胞懸液的鈣濃度提高到1μmol/L，室溫保存。灌流液用100%的O2飽和，灌流系統(tǒng)的溫度保持在37℃。

1.2.3 大鼠心室肌細(xì)胞通道電流的記錄 用膜片鉗全細(xì)胞記錄法，在電壓鉗制下記錄IK1。在室溫25℃下吸取上述細(xì)胞懸液1滴入細(xì)胞浴槽中，置于倒置顯微鏡(Olympus lX70，japan)工作臺(tái)上，待細(xì)胞貼壁后，用不同的灌流液持續(xù)灌流，流速2 mmol/L。選擇橫紋清晰、無(wú)收縮的細(xì)胞使用，微操縱器使阻抗為2～4MΩ、充滿電極內(nèi)液的玻璃微電極與細(xì)胞表面形成巨阻抗封接，然后擊破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄。信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗放大器(Axopatch 2008，USA)放大，經(jīng)電腦運(yùn)行pClamp 6.0.3)程序(Axon lnstru ments，USA)通過(guò)A/D、D/A轉(zhuǎn)換(Digidata 1200serious interface，USA)控制刺激的發(fā)放和信號(hào)采集。電流經(jīng)1 Hz濾波后儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)硬盤中。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo) 測(cè)定動(dòng)作電位的各項(xiàng)參數(shù) 靜息電位(resting potential，RP)、動(dòng)作電位幅度(action potential amplitude，APA)、最大去極化速率(maximum，Vmax)、動(dòng)作電位復(fù)極至50%、90%(action potential duration，APD50、APD90)的時(shí)間 。離子通道電流以正常細(xì)胞外液記錄的電流鋒值為100%，加藥后的電流為正常電流的百分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的葛根素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響

在臺(tái)氏液中記錄到動(dòng)作電位后，穩(wěn)定0.5 h，把0.005、0.01、0.015 mmol/L Pur分別加入到灌流液中，灌流 30min。結(jié)果顯示:不同濃度Pur對(duì)大鼠 RP、APA、Vmax的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均能延長(zhǎng)APD50、APD90，從而影響動(dòng)作電位時(shí)程，且隨著濃度的增大而增加(P＜0.05，P＜0.01，表1)。

Tab.1 Effects of the different concentration pur on action potential in rat myocardium(，n=6)

Tab.1 Effects of the different concentration pur on action potential in rat myocardium(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group RP/mV APAmV VmaxV/s APD50/ms APD90/ms Control -89.8±3.4 110.7±8.7 228.3±13.1 14.7±2.3 68.6±8.7 Pur(mmol/L)0.005 -87.1±2.3 112.6±9.3 234.4±16.2 17.6±3.8* 76.3±11.4*0.01 -85.9±2.7 109.9±6.1 237.2±18.6 29.7±4.9** 93.0±13.7**0.015 -71.7±3.1 108.2±29.4 236.6±19.4 40.8±5.4** 127.2±18.4**

2.2 不同濃度的葛根素對(duì)大鼠心室肌內(nèi)向整流鉀電流的影響

臺(tái)氏液中1μmol/L Nifedipine阻斷Ica-L，加20μmol/L TTX阻斷INa，常規(guī)電壓鉗下，保持電壓-40mV，鉗制電壓-120mV、持續(xù)500ms、階躍10mV、刺激頻率0.2Hz的去極化脈沖引出。灌流液中分別加入0.005、0.01、0.015 mmol/L Pur，記錄不同鉗制電壓下心肌細(xì)胞的IK1。結(jié)果顯示，不同濃度的Pur均能抑制不同去極化水平的 IK1，0.005 mmol/L Pur對(duì)IK1抑制率為18.6±2.1%(P＜0.05)、0.015 mmol/L Pur對(duì)IK1抑制率達(dá)到56%±1.8%(P＜0.01)并呈量效關(guān)系(圖 1見下頁(yè))。

3 討論

Fig.1 Effects of the different concentration pur on IK1in rat myocardium

大鼠心肌細(xì)胞電生理特點(diǎn)與人相似[2，3]，本實(shí)驗(yàn)用常規(guī)微電極方法和膜片鉗技術(shù)記錄Pur對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞AP、IK1的影響，以探討Pur抗心律失常的作用機(jī)理。本研究給藥前鉗制電位為-120～-60mV時(shí)，IK1為內(nèi)向電流，當(dāng)膜電位去極一外向電流減小，因此認(rèn)為記錄到的電流為IK1[4]。動(dòng)作電位3相快速?gòu)?fù)極化過(guò)程中，IK1為外向電流，其可促進(jìn)晚期復(fù)極[5]。用藥物抑制IK1這一外向電流，將抑制細(xì)胞復(fù)極化從而延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程。IK1通道在靜息電位-90mV下不易誘發(fā)心室肌細(xì)胞IK1的內(nèi)向電流，因此本研究保持電位-40mV，-120mV鉗制電壓下記錄葛根素對(duì)IK1的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同濃度的Pur能延長(zhǎng)心室肌細(xì)胞APD50、APD90，可能是通過(guò)減少內(nèi)向整流鉀電流實(shí)現(xiàn)的，這也可能是Pur延長(zhǎng)大鼠心室肌動(dòng)作電位時(shí)程的機(jī)理之一。由于心肌細(xì)胞動(dòng)作電位是由多種離子流構(gòu)成，因此還需研究Pur對(duì)其它離子流的影響才能得到Pur抗心律失常完整的結(jié)論。

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