徐 鵬，張佑紅，楊 益，彭繼明，陳 龍，靖志強(qiáng)，危 威，馬 靜，秦 琴

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system, BEVS)由于其表達(dá)的高效性、安全性等諸多優(yōu)點(diǎn)，在重組蛋白生產(chǎn)、疫苗的研制以及生物殺蟲劑等方面具有很高的應(yīng)用前景[1].為了提高重組蛋白或病毒的產(chǎn)量，必須準(zhǔn)確測(cè)定桿狀病毒與細(xì)胞的濃度比，即感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)[2-3].目前病毒滴度的測(cè)定方法主要是蝕斑法和終點(diǎn)稀釋法(EPDA)[4-5]，兩種方法都是利用病毒去感染細(xì)胞而間接得到病毒的滴度，測(cè)量過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且不同實(shí)驗(yàn)者之間測(cè)得的結(jié)果相差較大.

隨著近年來(lái)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的不斷發(fā)展，其檢測(cè)范圍不再局限于細(xì)胞，它已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域.Marie和Brussaard[6-7]等采用流式細(xì)胞儀通過(guò)特異性核酸熒光染料SYBR Green I染色成功地檢測(cè)并計(jì)數(shù)海洋病毒.在此基礎(chǔ)上，Shen[8]首次利用流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)桿狀病毒，但染色效果不好.本實(shí)驗(yàn)針對(duì)染色過(guò)程中的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證了改進(jìn)后方法的重復(fù)性和線性性，并對(duì)流式細(xì)胞術(shù)與終點(diǎn)稀釋法的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 病毒

野生型的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(wide type AcNPV)由武漢大學(xué)友好提供.

1.2 試劑及儀器

SYBR Green I(10 000×)和黃綠熒光微球(1μm)均購(gòu)于Molecular Probes公司；多聚甲醛購(gòu)于生工生物工程有限公司；Triton X-100購(gòu)于Amresco公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，BD公司生產(chǎn).

1.3 樣品制備

病毒樣品制備的主要步驟可分為固定、破膜和染色.待測(cè)病毒經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=8.0)稀釋后，加入一定量的多聚甲醛4 ℃下固定30 min，再放入-80 ℃超低溫冰箱15 min，然后置于室溫水浴中5 min，加入一定量的Triton X-100室溫放置5 min，最后加入SYBR Green I進(jìn)行染色，具體的影響因素及水平如表1所示.在上機(jī)檢測(cè)之前，加入已知濃度的黃綠熒光微球作為內(nèi)參.

表1 病毒染色過(guò)程的影響因素及水平

1.4 流式細(xì)胞儀分析

采用BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒樣品.前向散射光(FSC-H)、側(cè)向散射光(SSC-H)和綠色熒光(FL1-H)均以對(duì)數(shù)模式獲取.以FL1-H設(shè)定閾值，減少背景干擾.CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)，在SSC-H和FL1-H的雙參數(shù)散點(diǎn)圖上確定病毒和微球的位置(圖1).

圖1 SSC-H vs. FL1-H雙參數(shù)散點(diǎn)圖

“門”R1內(nèi)為加入的微球，“門”R2內(nèi)為待測(cè)的病毒.根據(jù)R1/R2可以推算出樣品病毒的滴度(1).

(1)

將得到的樣品病毒滴度乘以稀釋倍數(shù)便是原病毒樣本中的病毒滴度.

1.5 重復(fù)性和線性性檢測(cè)

線性性：PBS緩沖液稀釋桿狀病毒1000倍，取稀釋后不同體積(5～640 μL)的病毒測(cè)定其滴度，做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2.重復(fù)性：對(duì)同一個(gè)病毒樣本計(jì)數(shù)8次，計(jì)算變異系數(shù)CV.

1.6 流式細(xì)胞術(shù)與終點(diǎn)稀釋法的計(jì)數(shù)結(jié)果比較

為了比較改進(jìn)后的流式測(cè)量方法與傳統(tǒng)的病毒測(cè)定方法的準(zhǔn)確性，采用終點(diǎn)稀釋法[4]對(duì)同一病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：a.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞接種于96孔板中(100 μL/孔)，27 ℃下孵育24 h.b.以新鮮培養(yǎng)基連續(xù)10倍稀釋桿狀病毒(10-4～10-10).c.96孔板去上清，于每孔加入不同稀釋度的病毒100 μL，每稀釋度重復(fù)12孔，對(duì)照孔加入100 μL的新鮮培養(yǎng)基代替病毒液，27 ℃下孵育5～7 d.d.按Spearman-Karber法[9]計(jì)算病毒樣本的TCID50值.重復(fù)測(cè)量5次，計(jì)算變異系數(shù)CV.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定的影響

圖2顯示了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多聚甲醛固定對(duì)桿狀病毒計(jì)數(shù)的影響.采用多聚甲醛固定能夠維持病毒的原有形態(tài)，提高病毒的計(jì)數(shù)，但當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.1%后病毒的計(jì)數(shù)隨之減少.這主要是由于甲醛與DNA的相互作用，削弱了染料SYBR Green I與DNA的結(jié)合.病毒顆粒的熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著多聚甲醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低.

圖2 多聚甲醛固定的影響

注: 規(guī)定未經(jīng)固定處理的樣本熒光強(qiáng)度為1.

2.2 破膜處理

破膜的主要原理是利用驟冷驟熱或破膜劑的溶脂作用增強(qiáng)病毒顆粒的通透性，以便于染料的進(jìn)入.從圖3(a)可知，病毒樣本經(jīng)過(guò)凍融處理后，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但病毒計(jì)數(shù)卻隨之而減少，這可能是由于凍融導(dǎo)致一部分病毒的DNA與染料不能有效地結(jié)合.圖3(b)是Triton X-100終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的直方圖，與圖1相比較可知：經(jīng)破膜劑處理后，病毒的熒光信號(hào)分散，背景噪音增強(qiáng)，導(dǎo)致兩峰交疊，不利于病毒的準(zhǔn)確計(jì)數(shù).

(a)凍融處理的影響

(b)破膜劑處理的影響

Fig.3 Effects of permeabilization on baculovirus counts

注: 規(guī)定未經(jīng)凍融處理的樣本熒光強(qiáng)度為1.

2.3 染色溫度和時(shí)間的影響

孵育過(guò)程對(duì)病毒計(jì)數(shù)的影響顯著(圖4).孵育溫度的提高，一方面可以使病毒外殼失活，增強(qiáng)其通透性，另一方可以增強(qiáng)染料的活性，增加計(jì)數(shù)結(jié)果(圖4a)，但溫度過(guò)高對(duì)染色結(jié)果也不利.孵育時(shí)間不足，將導(dǎo)致染色不充分，病毒峰與背景峰交疊，不能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，當(dāng)孵育時(shí)間大于10 min后，計(jì)數(shù)結(jié)果保持穩(wěn)定(圖4b).

(a)孵育溫度的影響

(b)孵育時(shí)間的影響

Fig.4 Effects of incubation process on baculovirus counts

2.4 重復(fù)性和線性性檢測(cè)

對(duì)于重復(fù)性，8次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為1.22×1010病毒顆粒/mL，最大值為1.43×1010病毒顆粒/mL，最小值為1.01×1010病毒顆粒/mL，CV值為2.4%，這表明該方法的重復(fù)性較好.對(duì)于線性性，從圖5可知，病毒滴度在106～107病毒顆粒/mL范圍內(nèi)，線性性較好(R2=0.999 8).

圖5 不同加入體積的病毒計(jì)數(shù)

注：固定前所有樣本均加入PBS緩沖液稀釋至960 μL終體積.

2.5 流式細(xì)胞術(shù)與終點(diǎn)稀釋法的計(jì)數(shù)結(jié)果比較

分別采取流式細(xì)胞術(shù)和終點(diǎn)稀釋法測(cè)定同一批病毒的滴度，測(cè)量結(jié)果如表2所示.從表2可知，流式細(xì)胞術(shù)的重復(fù)性(CV=2.4%)明顯優(yōu)于終點(diǎn)稀釋法(CV=25.7%).表中流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)量結(jié)果是終點(diǎn)稀釋法的13.7倍，這是因?yàn)榱魇郊?xì)胞術(shù)是直接計(jì)數(shù)病毒，而終點(diǎn)稀釋法測(cè)量的是感染單位.一個(gè)感染單位對(duì)應(yīng)多個(gè)病毒顆粒，所以流式測(cè)量結(jié)果大于終點(diǎn)稀釋法.

表2 終點(diǎn)稀釋法與流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果的比較

3 結(jié) 語(yǔ)

病毒最佳染色條件：4 ℃下，0.1%的多聚甲醛固定病毒樣本30 min，然后加入SYBR Green I在80 ℃下避光染色10 min.經(jīng)改進(jìn)后的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定桿狀病毒的方法能夠快速而準(zhǔn)確的測(cè)定桿狀病毒的滴度.

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