文海榮,吳雅臻,李小萌

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科醫(yī)院,吉林長春130041;2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

CD147是一種分子量為50-60 kD的高度糖基化的單次跨膜糖蛋白,在眼角膜上皮、Müller細胞表面、視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium cell,RPE)和光感器細胞上均有表達,尤其在RPE中有高水平的表達[1]。CD147參與機體不同的病理生理過程,如機體的炎癥反應(yīng),細胞-細胞或細胞-基質(zhì)的粘附,刺激成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),導(dǎo)致基底膜和細胞間質(zhì)成分降解等。本研究通過觀察高糖條件下培養(yǎng)的RPE中CD147的表達變化,為糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的發(fā)病機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 低糖DMEM(含5.56 mmol/L葡萄糖)及高糖DMEM(含25mmol/L葡萄糖),FBS胎牛血清(美國GIBCO公司);Trypsin胰酶Trypsin胰酶粉(Sigma),CD147兔抗人一抗(中杉金橋),Cy3羊抗兔二抗(Sigma)。人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(中山大學(xué)細胞中心)。

1.2 實驗方法

1.2.1 RPE細胞培養(yǎng)與處理 將RPE細胞于完全培養(yǎng)基(DMEM中加入10%胎牛血清,1‰雙抗),置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶底80%左右時,用0.25%胰酶消化。在6孔細胞培養(yǎng)板中鋪4個蓋玻片,以2×105個/ml接種,100 μ l/孔。其中兩個孔加入1 ml高糖完全培養(yǎng)基,另外兩孔加入1 ml低糖完全培養(yǎng)基。將細胞混勻,用槍頭輕輕壓實鋪在12孔板中的玻璃片,以防止氣泡存留。將6孔板、放入37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中,待細胞長至80%-90%,做免疫熒光檢測。

1.2.2 免疫熒光檢測CD147蛋白在RPE細胞中的定位 吸去培養(yǎng)基,500 μ l/孔預(yù)冷PBS洗細胞,吸出。10%甲醛固定液 500 μ l/孔,搖床放置30分鐘。600 μ l/孔 PBS 洗三次 ,10 min/次 。0.1%TritonX-100 500 μ l/孔,搖床放置 5 min。600 μ l/孔 PBS 洗三次,10min/次。2%BSA-PBS 500 μ l/孔 ,搖床放置封閉90分鐘。600 μ l/孔PBS洗三次,10 min/次。加CD147一抗(兔抗人)抗體:1%BSA=1∶2 000,500 μ l/孔,4度過夜(12小時),600 μ l/孔PBS洗三次,10 min/次。避光加二抗Cy3(羊抗兔),抗體:1%BSA=1∶1 000,300 μ l/孔 ,搖床放置 30 分鐘 。600 μ l/孔 PBS 洗三次,10 min/次。封片液封片,鏡檢。

1.2.3 Western blot檢測CD147蛋白在RPE細胞中的表達 實驗細胞加入全細胞裂解液200 μ L,吹打裂解后,將裂解液置于4℃,12 000 r/min離心15 min,取上清液。定量樣本加入6×樣品緩沖液,行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。SDS-PAGE結(jié)束后,將凝膠與PVDF轉(zhuǎn)印膜一起按電轉(zhuǎn)移裝置說明書要求安裝并放入電泳槽中,加電轉(zhuǎn)液在80 mA電流轉(zhuǎn)移4 h。轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉封閉,一抗用封閉液以1∶1 000濃度稀釋,按0.1 ml/cm2加到PVDF膜上,4℃過夜,孵育10 h。二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG,加到PVDF膜上,室溫反應(yīng)2 h。ECL法化學(xué)發(fā)光,X線底片曝光顯影。β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測CD147在RPE細胞上的分布CD147蛋白在RPE細胞中高表達。在低糖條件下,CD147主要集中在細胞核中,一部分位于細胞質(zhì)中(圖1)。在高糖條件下,CD147主要分布于細胞膜上,一部分位于細胞質(zhì)中,細胞核中的CD147蛋白很少(圖2)。

2.2 Western blot檢測CD147在RPE細胞上表達量 CD147蛋白在RPE細胞上有表達。高糖條件下RPE細胞上CD147蛋白的表達量明顯高于低糖條件下RPE細胞上的CD147蛋白(圖3)。

圖1 低糖條件下CD147蛋白在RPE細胞中的分布

圖2 高糖條件下CD147蛋白在RPE細胞中的分布

圖3 不同培養(yǎng)條件下CD147蛋白在RPE細胞上的表達量變化

3 討論

CD147又稱基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子,屬于免疫球蛋白超家族成員,在體內(nèi)分布非常廣泛,參與各種不同的生理過程并具有多種不同的生理功能。近幾年對CD147的研究主要集中在腫瘤疾病中,發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤疾病中CD147可促進細胞的異常增生,并通過上調(diào)MMPs的表達,促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。且CD147的表達水平與腫瘤的惡性度正相關(guān)[2]。CD147還可與整合素作用影響細胞基質(zhì)構(gòu)建[3]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中,CD147可同過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達促進的新生血管生成[4]。近來一些對于鼠RPE細胞上CD147的研究顯示,CD147可能介導(dǎo)正常感光細胞與膠質(zhì)細胞間的相互作用,與多聚單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白一起參與RPE和Müller細胞的漿膜轉(zhuǎn)運、能量代謝[5]。

本研究結(jié)果顯示CD147蛋白在RPE細胞上存在表達,同時存在于胞膜、胞漿和胞核中。在低糖培養(yǎng)條件下,CD147蛋白主要集中在細胞核中,一部分位于細胞漿;在高糖培養(yǎng)條件下,RPE細胞變長,CD147在RPE中的定位發(fā)生變化,由細胞核向細胞膜轉(zhuǎn)移,主要存在于細胞膜上,部分位于細胞漿。由于CD147是一種膜蛋白,主要通過糖基化的程度和方式不同,與其他蛋白相互作用發(fā)揮作用,因此我們推測當(dāng)環(huán)境中的葡萄糖濃度增加時,CD147蛋白由細胞內(nèi)向細胞膜轉(zhuǎn)移,在細胞膜上的功能性蛋白增多發(fā)揮更強的生物學(xué)作用。Western-blot結(jié)果證實,在高糖條件下CD147蛋白在RPE細胞中的表達量較低糖條件下明顯增加。再次提示CD147蛋白可能參與了高糖條件下RPE細胞的生物學(xué)特性的變化。

綜上我們可以推測,在高糖條件下,CD147蛋白的修飾及表達變化,促進RPE細胞的生物學(xué)特性的變化。這為我們研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制提供了新的思路。

[1]Tervahartiala T,Kaarniranta K,Tang Y,et al.Immunolocalization of EMMPRIN(CD147)in the human eye and detection of soluble form of EMMPRIN in ocular fluids[J].Current Eye Research,2006,31:917.

[2]Nabeshima Kazuki,Iwasaki Hiroshi,Kaga Kaori,et al.Emmprin(basigin/CD147):matrix metalloproteinase modulator and multifunctional cell recognition molecule that plays a critical role in cancer progression[J].Pathology International,2006,56(7):359.

[3]Jiang Jian-li,Tang Juan.CD147 and its interacting proteins in cellular functions[J].Acta Physiologica Sinica,2007,59(4):517.

[4]Tang Y,Nakada MT,Rafferty P,et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression by EMMPR IN via the PI3K-Akt signaling pathway[J].Mol Cancer Res,2006,4(6):371.

[5]Kenji Hori,Naomi Katayama,Sbu Kacbi,et al.Retinal Dysfunction in Basigin Deficiency[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:3128.